[发明专利]一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，它是由多肽序列Pep与铜离子构建而成；所述的多肽序列Pep序列为：HQHYHGGGGS‑DOPA‑DDDD。本发明基于仿生原理设计Pep分子，与铜离子高效结合构建LOX多肽模拟酶，实现了与LOX在三维结构‑体外活性‑催化机制上的高度一致。该模拟酶制备简单、活性稳定、生物相容性良好，进一步负载于GelMA凝胶中缓慢释放，长期维持有效治疗浓度，具有很好的治疗糖尿病骨缺损的功效。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有赖氨酰氧化酶(LOX)活性的多肽类模拟酶及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病骨的高糖微环境使得骨胶原交联过程中唯一的催化酶——赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)处于严重下调状态，成为糖尿病骨损伤延迟愈合甚至不愈合的主要原因。为此，在骨伤局部补充LOX，促进骨胶原的交联成熟，已成为加速糖尿病患者骨再生新的治疗策略。然而，目前该策略的最大障碍在于LOX的体外重组表达效率低下、结构不稳定以及复性后易失活。因此，开发一种简便易得、活性稳定的LOX活性替代物意义重大。

近年来，随着对天然酶分子的结构功能关系以及催化机制研究的不断深入，越来越多的研究者成功实现了以简单的合成小分子来替代复杂的天然酶，从而得到比天然酶制备更简便、活性更稳定的模拟酶。多肽凭借制备简单、稳定性好、免疫原性低、生物相容性高等优势成为构建模拟酶的理想材料，其组装方式与天然酶分子的折叠过程类似，并可为底物的结合提供有利的微环境。

发明内容

本发明提出借助模拟酶的仿生思路，设计一种具有LOX活性的多肽模拟酶，并研究其结构和催化活性，以及在糖尿病骨缺损大鼠模型中的应用。

本发明的LOX多肽模拟酶(peptide mimic of LOX,PML)是一种源于LOX活性结构域氨基酸残基而设计的多肽片段(peptide,Pep)与活性中心二价铜离子的结合物。其三维结构类似于天然LOX，Pep通过组氨酸咪唑氮和邻醌氧与铜离子发生结合，表现出LOX活性，催化胶原交联反应，促进骨胶原的分泌和成熟，加速糖尿病骨愈合。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种具有赖氨酰氧化酶活性的多肽模拟酶，它是由多肽序列Pep与铜离子构建而成；

所述的多肽序列Pep序列为：HQHYHGGGGS-DOPA-DDDD。

本发明提供一种具有LOX活性的多肽模拟酶的设计方法，包括以下步骤：

(1)LOX活性结构域的解析：总结LOX催化胶原交联的关键结构及作用包括：催化中心Cu²⁺发挥稳定辅因子LTQ氧化态的作用；组氨酸参与Cu²⁺配位，稳定催化域；天冬氨酸提供阴离子环境，结合底物；LTQ与Cu²⁺配位的同时，参与氧化脱氨反应。

(2)Pep序列的设计：利用仿生模拟酶的构建思路，本发明设计了源于LOX活性域的多肽序列(Pep：HQHYHGGGGS-DOPA-DDDD)，其中HQHYH为铜离子结合序列，DOPA为LTQ模型氨基酸，GGGGS为连接序列，DDDD为底物亲和序列。

本发明所述的Pep分子结构如下：

(3)PML分子的设计：鉴于Cu²⁺在LOX活性中的关键作用，将Cu²⁺掺入并稳定结合于氧化态的Pep分子中，设计出具有LOX活性的PML。

(4)分子动力学模拟计算PML与LOX的构象一致性：首先使用Pymol开源版本构建了含有非标准残基的PML结构，使用Avogadro对整体结构进行了调整和优化，将初始结构进行能量最小化后使用Amber ff14SB力场进行分子动力学模拟，对PML的分子结构进行构象分析。