[发明专利]一种降纤酶的制备方法

说明书

本发明属于提取物制备技术领域，具体是涉及一种降纤酶的制备方法，包括如下步骤：将含有蛇毒的原料进行阴离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析，每次层析后进行浓缩，处理，得到降纤酶，所述阴离子交换层析的次数为至少2次；本申请可以显著的提高降纤酶的纯度，减少杂质，提高纯化效果。

技术领域

本发明属于提取物制备技术领域，具体是涉及一种降纤酶的制备方法。

背景技术

降纤酶通过专一性的激活或灭活作用后，该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤，产生促凝或抗凝效应，在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚，起凝血作用。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。

降纤酶本身为白色非结晶粉末，有引湿性，易溶于水。有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力作用。

现有技术降纤酶的制备方法较多，但多因步骤多、时间长、收率低、蛋白构成不稳定导致其活性低，染菌污染的风险较大等缺陷。

这些分离纯化降纤酶的方法有：

1﹚取DEAE-Sephadexa-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶a-50，简称a-50)，加入新鲜蒸馏水，加热煮沸15min，放至室温，加pH7.6的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液搅拌，放置数小时，弃去上清液，再加入上述缓冲液，如此反复数次，测pH为7.6，即达平衡。用上述缓冲液平衡，是因为降纤酶的最适pH为7.4～7.6，且在pH7.6的条件下，a-50稳定。再将蛇毒粗品均匀加在a-50柱中。洗脱条件，第一梯度，在搅拌瓶中加pH7.6，含0.1mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液1000mL；第二梯度，在搅拌瓶中加pH7.6，含0.1mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液1000mL，贮存瓶中pH7.6，含0.1mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液1000mL。共分离出9个峰，将合格峰合并，即得降纤酶。

2)将尖吻蝮蛇蛇毒20克溶于8.0的缓冲液1000mL中，上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.15mol/L氯化钠的缓冲液洗脱，收集含降纤酶活性成分的溶液。亲和层析填料系用经溴化氰活化，接上二氨基二丙基胺后经琥珀酸化，偶联亲和降纤酶的配基而成。将柱层析收集的洗脱液上亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗后，用含0.2mol/L盐酸胍的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液，经超滤去盐浓缩，冻干，即得产品。此法从蛇毒20克制得产品69.3毫克，比活2886单位/毫克。

从以上文献中可以看出，由于蛇毒中降纤酶目标蛋白含量低，杂蛋白干扰大，不管是单一运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析还是疏水层析，其中哪种都很难纯化到高纯度的降纤酶目标蛋白。另一方面，降纤酶稳定性差，不选择恰当的缓冲液和贮藏条件，即使分离到高纯度目标蛋白，也会很快降解，文献中公开的工艺很难应用于产业化，所以开发一种纯度高、稳定性好能运用于大规模生产的降纤酶工艺成为一种迫切需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种降纤酶的制备方法，纯度高，杂质少。

本发明的内容为一种降纤酶的制备方法，包括如下步骤：将含有蛇毒的原料进行阴离子交换层析，疏水层析和金属螯合亲和层析，每次层析后进行浓缩，处理，得到降纤酶，所述阴离子交换层析的次数为至少2次；

首次的阴离子交换层析采用的洗脱方式为以A液和B液为洗脱液进行梯度洗脱，其中，所述A液为含有吐温20的Tris HCl缓冲液，所述B液为含有吐温20和氯化钠的Tris HCl缓冲液；

第二次的阴离子交换层析采用的洗脱方式为以A液和B液为洗脱液进行梯度洗脱，其中，所述A液和B液都为含有吐温20和氯化钠的醋酸缓冲液，其中B液的氯化钠的浓度高于A液；

所述疏水层析采用的洗脱液为含有0.5-2.5mol/L的醋酸铵的缓冲液；