[发明专利]一种应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法

权利要求书

1.一种应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、检测样本收集；

S2、HIV-1样本制备：从检测样本中提取HIV-1病毒的RNA，通过RT-PCR、巢式PCR扩增pol区包含耐药突变位点的基因片段，最后利用电泳对扩增样品进行检测；

S3、文库构建：对目的基因片段化、加标签，最后混合样本，变性稀释到上机浓度，达到可在Illumina测序平台上对混合文库进行双序列标签测序的要求；

S4、上机测序：采用最大产出为2.4G的中通量测序试剂盒，在Miniseq测序仪上对混合文库进行2×150bp的双端NGS测序；

S5、数据分析：对下机数据进行过滤、质控和拼接，从中提取出测序深度和覆盖率，并利用斯坦福大学HIV耐药解释系统对数据进行耐药分析与报告。

2.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S1中，检测样本可为血浆样本或血清样本，其中，血浆样本采用的抗凝剂为EDTA。

3.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S2中，对HIV-1病毒RNA的提取的过程中，具体包括以下步骤：

S21、取出预封装试剂，颠倒混匀使磁珠重悬，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，沿板子方向小心撕去铝箔封口膜；

S22、在96深孔板试剂的第1列和第7列孔中先后加入体积比为10:1的样品和Proteinase K溶液，将96深孔板放入核酸提取仪中，装上磁棒套，确认磁棒套安装到位后进行自动化提取；

S23、自动化程序结束后，将第6列和第12列孔中的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，置于-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S2中，利用电泳对扩增样品进行检测的过程中，具体包括以下步骤：

琼脂糖凝胶电泳：

称取琼脂糖到三角烧瓶中，然后加入1×TAE电泳缓冲液，放入微波炉中高火加热3min-5min，室温冷却到50℃左右，再加入TS-GelRed核酸凝胶染色剂混匀，最后将上述溶液倒入制胶器中，室温下静置30min，待胶凝固后吸取产物与上述缓冲液混匀，加入琼脂糖加样孔中，电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40min后通过凝胶成像查看结果；

Qubit荧光定量：

制备1×TE缓冲液：用无核酸酶水将20×TE缓冲液稀释20倍，混匀；

制备染料工作液：用1×TE缓冲液按1:400稀释QuantiFluorRds DNA Dye并混匀；

在0.5ml Ep管中，将1×TE/和DNA standard/待测样本分别与100倍体积的染料工作液混合，涡旋混匀，室温下避光孵育5min后用仪器检测；

PCR产物稀释：

用无核酶水将定量后的PCR产物稀释到1ng/μl。

5.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S3中，对目的基因片段化、加标签的过程中，具体包括以下步骤：

S31、涡旋使TNB充分混匀，然后按照10μl 5×TTBL、1μl 1ng DNA、5μl TTE Mix V50、4μl ddH₂O配制反应体系，使用移液器吹打使其充分混匀；

S32、将反应管置于PCR仪中进行反应，反应完成后立即向产物中加入5×TS，使用移液器吹打至充分混匀，置于室温放置5min；

S33、将PCR管置于冰上，按照25μl上一步产物、10μl 5×TAB、5μl N5XX、5μl N7XX、1μlTAE、4μl ddH₂O配制反应体系；

S34、使用移液器吹打至充分混匀，将反应管置于PCR仪中进行反应。