[发明专利]一种羟胺苯变位酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。本发明通过将来源于Pseudomonas oleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3‑羟基氨基乙酰苯转化为3‑氨基‑2‑羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176U提高至1.40U。本发明提供羟胺苯变位酶突变体在3‑氨基‑2‑羟基苯乙酮的生物合成中具有较大工业前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。

背景技术

普仑司特(Pranlukast)是一种口服支气管哮喘治疗药物，属于白三烯(CysLTs)受体拮抗剂，能够有效抑制LTD4受体从而治疗哮喘。普仑司特因具有选择性抑制强、适用性广、副作用小等特点，拥有广阔的市场前景和重大研究价值。

3-氨基-2-羟苯乙酮，英文名为1-(3-Amino-2-hydroxyphenyl)ethanone(简称3AHAP)，是合成普仑司特的关键中间体，其合成方法主要是化学合成法，可通过四步反应途径获得。该途径的第二步涉及Fries重排，该重排涉及酚酯在Lewis或Bronsted酸的催化下重排为o-或p-酰基苯酚。然而，由于使用氯仿和二氯甲烷等有机溶剂，这一步骤具有很高的环境污染风险。同时，反应系统中使用的催化剂，如AlCl₃、BF₃和TiCl₄，会释放有毒气体，对环境有害。

生物合成法是指利用生物催化剂(如酵母菌、细菌、真菌等)或生物转化反应，将底物转化为所需化合物的一种合成方法，利用生物体自然代谢活动的结果，不需要高温、高压等条件，且不会产生有毒有害的废物和污染，是一种绿色、环保的化学合成方法。因此，3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成研究具有重要意义。

3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成依靠多酶体系催化，并适合于体外多酶催化。羟胺苯变位酶nitrobenzenenitroreductase(nbzA)是一类分布广泛的黄素蛋白酶，与辅基FMN或FAD分子结合，以辅酶NAD(P)H作为电子供体催化硝基基团生成相应的羟胺或氨基基团。3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成反应以辅酶循环NADPH-GDH作为氢供体，首先经硝基还原酶(nbzA)催化底物间硝基苯乙酮的硝基还原为羟氨基，然后经羟胺苯变位酶(habA)催化羟胺基重排生成3AHAP。但现有羟胺苯变位酶的催化活性较低，因而导致3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成受限。

发明内容

为了解决上述羟胺苯变位酶的催化活性低的技术问题，进而解决3-氨基-2-羟苯乙酮的生物合成产率低的问题，本发明提供了一种羟胺苯变位酶突变体及其应用。本发明通过将来源于Pseudomonasoleovorans的野生型羟胺苯变位酶序列进行第115位、93和81位的突变，筛选得到羟胺苯变位酶突变体，突变体在催化3-羟基氨基乙酰苯转化为3-氨基-2-羟基苯乙酮的过程中，相较于野生型酶活力大大提高，最大可从0.176U提高至1.40U。

本发明的具体技术方案为：

本发明提供了一种羟胺苯变位酶突变体L115G，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体L115P，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体L115C，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体L115H，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体L93A，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体V81G，氨基酸序列如SEQID NO.7所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体V81E，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体V81R，氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体V81L，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；或提供了一种羟胺苯变位酶突变体V81A，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。