[发明专利]卡拉胶在生物3D打印中的应用

说明书

本发明公开了卡拉胶在生物3D打印中的应用，生物3D打印包括生物墨水和支撑浴，卡拉胶与GelMA溶液的组合在生物墨水中的应用，卡拉胶与磷酸盐缓冲液的组合在支撑浴中的应用。本发明采用上述成分的卡拉胶在生物3D打印中的应用，可有效操控无法挤出式打印的生物材料，如明胶衍生物GelMA的精准定位打印。

技术领域

本发明涉及生物3D打印技术领域，特别是涉及卡拉胶在生物3D打印中的应用。

背景技术

常用于细胞3D培养的高活性生物材料，主要有胶原蛋白，纤维蛋白，脱细胞外基质(dECM)、明胶衍生物GelMA等。其中，甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)为烯烃双键改性的明胶，由甲基丙烯酸酐(MA)接枝取代明胶上的氨基获得，可光交联形成具有一定强度适于细胞生长与分化的三维结构，GelMA兼具天然和合成生物材料的特征，具备可逆的温敏交联特性和不可逆的光交联特性，由于其优异的生物活性和可调的理化性能，使得GelMA在组织工程等领域被广泛地使用，逐渐成为细胞3D培养的首选材料。

然而，GelMA的生物3D打印一直面临巨大的挑战。对于应用最广泛的挤出打印，由于GelMA粘度极低，类似于水，无法进行直接挤出打印，排除影响细胞相容性的混合打印，当前挤出打印GelMA的策略有、冷凝打印、原位光交联打印。由于原位交联程度难以控制，打印过程相对难以操控，目前的普及度较低，主要流行的还是通过冷凝增稠进行打印。

冷凝打印GelMA，主要是利用GelMA的冷凝特性预冷凝增稠进行打印，但由于明胶温敏性较窄，在室温24℃以上开始热溶，打印时需要控制GelMA预冷凝增稠程度，同时还需要控制打印时的环境温度，对温度控制的要求高且导致打印不稳定。此外GelMA冷凝形成的凝胶粘性较高，弹性较大，不利于顺畅挤出，综上，导致GelMA冷凝打印策略用户体验不好，有待进一步优化，提高其用户体验感和普适性。

生物功能化是后续各种组织工程与再生医学应用场景的保障，生物3D打印最终目标是构建功能化活性组织，相比于墨水的可打印性，墨水的生物活性是需要考虑的第一要素。然而，高活性生物材料配方墨水一般呈低粘度强度的理化属性，与可打印性的高粘度高强度要求背道而驰，无法直接挤出打印。致使墨水普适性高、应用最为广泛的挤出式生物3D打印长期处于平衡生物墨水活性和可打印性的矛盾性难题中。

随着生物3D打印发展，针对低粘度低强度墨水难以打印的难题，提出一种支撑浴介质中进行挤出式打印的技术，悬浮打印允许针头移动划开悬浮支撑液形成缝隙的同时沉积墨水到缝隙当中。悬浮支撑介质的存在使得打印丝避免了重力作用下的变形和坍塌。随后，关于各种材料制备支撑浴进行悬浮打印的研究陆续涌现，如卡波姆、琼脂糖、海藻酸盐、结冷胶、明胶等微胶体颗粒型支撑浴。

研究者们总结出，适于悬浮打印的支撑浴需具有宾汉流体特性，即当针状喷嘴在支撑浴里运动时，高剪切力使支撑浴呈流体特性，但在喷嘴移动的后方剪切力消失，支撑浴可快速自愈合并转换为刚性，可瞬间将挤出墨水包裹、固定在原位，从而实现层层沉积成形。

然而，目前为了防止墨水在支撑浴内扩散，多是针对墨水的交联机制，在支撑浴内构建墨水的实时交联环境，导致用于悬浮打印的墨水多是接触式交联机制的材料，如离子交联、酶交联、pH交联，对于非接触式交联的材料，如光交联，不太适用。同时，目前已知的支撑浴，自愈合速度有限，打印时，为了避免墨水被支撑浴挤压在喷头划过的裂缝中自由流动导致无法打印，要求墨水具有一定的初始粘度，以减缓其流动性。

而对于非粘性低粘度光交联GelMA的悬浮打印，有研究者利用亚硫酸根可实现GelMA交联的机制，开发出含有亚硫酸根的支撑浴用于悬浮打印GelMA。由于亚硫酸根固化GelMA的速度较慢，无法实现GelMA的快速原位交联封装，加上所使用支撑浴的自愈合速度有限，需要提高GelMA的浓度(＞10％w/v)来提高墨水粘度和原位交联封装速度，防止其扩散，但是高浓度的GelMA不利于包裹细胞的生长。目前能用于自由悬浮打印全粘度范围内GelMA的支撑浴还未见报道。

发明内容