[发明专利]一种监测qPCR反应干扰的内标系统及应用

说明书

本发明涉及qPCR技术领域，具体公开了一种监测qPCR反应干扰的内标系统及应用。包括：内标系统引物、内标系统探针和内标系统模板，由于所设计的内标系统对qPCR反应干扰物质，如乙醇、EDTA等，有更敏感的反应，即可为qPCR定量或定性检测，提供了样本干扰性判断的参考依据，确认对样本报告的可靠性。除此之外，内置反应母液中的内标系统，还为操作过程中的移液或分液操作误差提供了另一个维度的参考，极大提高了检测报告的可靠性。

技术领域

本发明涉及qPCR技术领域，具体为一种监测qPCR反应干扰的内标系统及应用。

背景技术

传统的PCR通常采用终点法进行检测。核酸扩增反应结束后，通过染色处理及电泳分离，对扩增产物的片段大小以及条带染色亮度进行判断，以半定量或定性方式完成分析，且因需要打开扩增反应管，通过额外移液操作完成电泳和染色，易造成环境污染，引发假阳性，使该应用，特别是在临床检验上受到限制。荧光定量PCR技术不仅实现了对样本特定核酸片段的定量估计，且兼具灵敏度高、特异性和可靠性好、自动化程度高和污染率低的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR，用于检测或体外诊断。

荧光定量PCR（简称qPCR）检测的Ct值是定量的核心，是荧光信号到达设定的阈值或曲线拟合的拐点时，所经历的循环数，该循环数与起始反应中目的基因的拷贝数成正相关，因此可以采用Ct值来计算样本中目标基因的含量。影响Ct值的因素有很多，比如反应用耗材或样本预处理引入的PCR反应干扰物质、操作人员的操作误差等。操作误差或干扰物质的存在可能导致样本检测Ct值与实际水平有较大的差距，或滞后，或提前，影响报告值的准确度，特别在临床诊断、动植物检疫检验或药品质量放行中影响对结果的判断。因此qPCR检测反应中常见设置各种参考对照，用于协助判断对样本报告的可靠程度，如用阳性参考品，佐证检测反应无干扰；阴性参考品，用于确认反应系统无污染等等。对核酸扩增检测而言，常常需要事先从各种类型样本中分离DNA或RNA核酸，再进行检测。由于样本中常含有的各种各样的干扰物质，如粪便样本中的胆红素，以及核酸提取过程中防止核酸酶降解核酸的乙二胺四乙酸（EDTA），或纯化核酸用的乙醇洗液，都会干扰PCR反应，影响qPCR定量或定性报告的准确度和可靠性，因此就有必要设立一种内部参考对照来监控由样本或核酸提取过程引入的反应干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种监测qPCR反应干扰的内标系统及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种监测qPCR反应干扰的内标系统，包括：内标系统引物、内标系统探针和内标系统模板；

所述内标系统引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述内标系统探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

所述内标系统模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的内标系统引物终浓度为0.1μM、内标系统探针终浓度为0.1μM，内标系统模板在反应体系中的终浓度为1000~100000拷贝/体系。

优选的，所述内标系统探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述的荧光淬灭基团选自MGB、BHQ或TAMRA中的任意一种。

优选的，所述的荧光报告基团为HEX，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。

一种监测qPCR反应干扰的内标系统的应用，其为利用上述所述的内标系统对待测样本进行干扰物质检测。

优选的，所述干扰物质为乙二胺四乙酸或乙醇中的任意一种。