[发明专利]一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用

权利要求书

1.一种亚油酸合酶基因，其特征在于，亚油酸合酶基因为FAD2，亚油酸合酶基因FAD2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.如权利要求1所述的亚油酸合酶基因，其特征在于，亚油酸合酶基因FAD2编码蛋白质的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.2。

3.一种实施如权利要求1～2任意一项所述的亚油酸合酶基因的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，从红酵母菌株中克隆得到一个新的亚油酸合酶基因，将其转入酿酒酵母菌株中，经脂肪酸生物合成相关代谢途径的优化，获得亚油酸的酿酒酵母工程菌株。

4.如权利要求3所述的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，提取酵母总RNA并反转录成cDNA；

步骤二，以cDNA为模板设计特异性引物，通过PCR扩增亚油酸合酶基因；

步骤三，通过琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤二中的PCR产物进行回收并纯化，得到亚油酸合酶基因FAD2片段。

5.如权利要求3所述的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，步骤二中，采用2xPhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶进行PCR扩增；

PCR扩增体系为：2xPhantaMaxMasterMix10μL，正反向引物各0.5μL，ddH₂O8μL，模板1μL，总反应体系20μL；

PCR扩增反应条件为：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃1min，32循环；72℃5min。

6.一种实施如权利要求1～2任意一项所述的亚油酸合酶基因的亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法包括：以酿酒酵母为出发菌株，酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，敲除FAA4和FAA1基因，过表达TGL1、TGL3、TGL5和FAD2基因；其中，TGL1基因整合到FAA4基因位点；TGL3和TGL5基因整合到FAA1基因位点；FAD2基因与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，整合到NDT80位点。

7.如权利要求6所述的亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法包括以下步骤：

(1)利用重叠PCR构建模块I～模块VII；

(2)构建菌株P01：将表达模块II转化酿酒酵母BY4741菌株，利用酵母缺陷型培养基SD-HIS筛选培养，得到菌株P01；

(3)构建菌株P02：将表达模块V转化酿酒酵母P01菌株，利用酵母缺陷型培养基SD-HIS-URA筛选培养，得到菌株P02；

(4)构建菌株P03：将表达模块VII转化酿酒酵母P02菌株，利用酵母缺陷型培养基SD-HIS-URA-LEU筛选培养，得到生物合成亚油酸的酿酒酵母工程菌株P03。

8.如权利要求7所述的亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的模块I～模块VII的构建包括：

1)将基因TGL1、组成型启动子PGK1p和终止子ADH1t重叠，构建PGK1p-TGL1-ADH1t表达模块，命名为模块I；

2)将模块I与HIS筛选标记重叠，构建HIS-I表达模块，命名为模块II；

3)将基因TGL3、组成型启动子PGK1p和终止子ADH1t重叠，构建PGK1p-TGL3-ADH1t表达模块，命名为模块III；

4)将基因TGL5组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，构建TEF1p-TGL5-CYC1t表达模块，命名为模块IV；

5)将模块III、IV和筛选标记URA重叠，构建URA-III-IV表达模块，命名为模块V；

6)将基因FAD2与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，构建表达模块TEF1p-FAD2-CYC1t，命名为模块VI；

7)将模块VI与筛选标记LEU重叠，构建表达模块LEU-VI，命名为模块VII。