[发明专利]一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法

说明书

本发明公开了一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法，包括下述步骤：1)将棘孢小单孢菌的孢子接种至液体培养基中进行预培养，然后对菌体分别进行收集、重悬、热激处理获得棘孢小单孢菌受体菌；2)将供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌混合后共培养，共培养结束后，再涂布于另加入Mg²⁺的ISP4固体培养基或另加入Mg²⁺的改良的2CM固体培养基或另加入Mg²⁺的2CM固体培养基中培养即可生长出接合转移子。该方法操作简单，周期短，效率高，可以克服工业生产菌株遗传操作困难的局面，为更高效的对棘孢小单孢菌工业菌株进行定向遗传改造奠定基础。

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法。

背景技术

放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的原核生物，作为极其重要的微生物资源而受到广泛关注。放线菌能产生大量的次级代谢产物，目前应用的抗生素约70％是由各种放线菌所产生，在医药工业、农业等方面有重要意义。放线菌科种类繁多，包含链霉菌属、放线菌属、小单孢菌属、游动放线菌属等。采用基因工程手段改造放线菌以实现提高产量、降低或去除杂质组分、激活沉默基因表达、改造化合物结构或产生新结构化合物，从而实现放线菌工业菌株的构建，这是目前放线菌研究工作的主要目的。

庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于各种细菌感染类疾病的治疗，是我国抗感染必备的基本药物。工业上主要采用棘孢小单孢菌(Micromonospora echinospora)作为庆大霉素的生产菌。因此，对棘孢小单孢菌进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，意义重大。

接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从供体向受体转移的过程，是水平基因转移的主要方式之一，也是目前最广泛应用于放线菌的基因转移方法。接合转移步骤简单、操作方便且耗时短，已在多种链霉菌中成功应用，尤其是在模式菌种中，操作流程已相当成熟。相较于链霉菌，其他的稀有放线菌例小单孢菌由于缺乏通用的遗传操作系统导致遗传操作困难从而限制了进一步的研究，尤其对于工业生产菌株而言，菌株背景的复杂性导致存在许多不可预知的因素，接合转移的效率普遍较低。专利CN201610158588.2中采用TSB液体培养基来萌发红色糖多孢菌工业生产菌株的孢子进行接合转移，效率最高仅为2×10^-5。总体上与小单孢菌遗传操作方法有关的文献较少，对于棘孢小单孢菌工业菌株，采用传统的孢子热激法进行接合转移(《Practical Streptomyces Genetics》2000)基本得不到转化子。为此，有必要继续优化接合转移的方法，进一步提高接合转移效率，建立一套合适高效的遗传操作体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种棘孢小单孢菌工业生产菌株接合转移方法，该方法操作简单，周期短，接合转移效率高。

本发明提供了一种棘孢小单孢菌工业生产菌株的接合转移方法，包括以下步骤：

1)将棘孢小单孢菌的孢子接种至液体培养基中进行预培养，然后对菌体分别进行收集、重悬、热激处理获得棘孢小单孢菌受体菌；

2)将供体菌与步骤1)中的棘孢小单孢菌受体菌混合后共培养，共培养结束后，再涂布于另加入Mg²⁺的固体培养基中培养即可生长出接合转移子；