[发明专利]一种鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开一种鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒及检测方法。以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的鸡滑液囊支原体抗原蛋白MS‑eLPD作为包被抗原构建鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒及检测方法，用于检测鸡滑液支原体抗体水平，与鸡毒支原体阳性血清、鸡传染性支气管炎阳性血清、鸡传染性法氏囊病阳性血清、禽白血病阳性血清、禽网状内皮组织增生症阳性血清、鸡传染性鼻气管炎阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性和重复性，为鸡滑液支原体的临床诊断、流行病学研究和免疫检测提供了有效的手段。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)是一种常见细胞外病原体，可引起禽类慢性呼吸道疾病、蛋壳尖端异常、传染性滑膜炎和关节炎。鸡群感染可引起严重的炎症反应，并逃避免疫识别，给全球家禽业造成严重的经济损失。

由于滑液囊支原体多为隐形感染而呈亚临床症状，因此对该病的实验室诊断是极为重要的。目前，MS抗体的检测方法主要为血清学检测方法，包括血清平板凝集试验(SPA)、血凝抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。SPA和HI敏感性低，且很难适用大批量临床样品的检测。ELISA是一种灵敏、简单、快速的检测方法，此方法的特异性高、敏感性高、可以同时检测大量抗体样品。现在市场上商品化的MS抗体检测试剂盒来自BioChek和IDEXX，均为进口试剂盒，价格昂贵。因此，开发更为经济的MS抗体ELISA检测试剂盒来替代进口产品对我国MS感染情况的监测具有重要意义。

前人研究发现，MS成功附着和定殖在宿主上皮的关键是因为其膜上含有丰富的脂质相关膜蛋白(Lipidassociatedmembraneproteins，LAMPs)，具有很强的免疫原性。在本研究中，参照GenBank中滑液支原体WVU1853株，通过多种生物信息学工具综合分析DLD、LP78、LDH、ENO蛋白的结构和功能，选取参数较好的肽段，适当优化、合成并进行了原核表达。并通过IPTG诱导和纯化靶蛋白(MS-eLPD)，通过Westernblot和ELISA方法对其反应原性进行验证。以纯化的MS-eLPD蛋白作为包被抗原，建立MS抗体间接ELISA检测方法。这为多蛋白联合应用与开发检测MS抗体高灵敏性新方法提供了机会。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先采用生物信息学软件及相关网站分析MS结构蛋白的优势线性表位，获得抗原表位序列，通过Protean软件分析抗原位点情况，并命名为MS-eLPD；再通过遗传密码子将多表位肽的氨基酸序列推导为核苷酸序列，尽可能选择大肠杆菌优势密码子，抗原表位肽核苷酸序列送生物公司进行基因合成，并通过连接酶将目的基因和质粒进行连接；将MS-eLPD重组原核表达质粒转化DH5α感受态细胞，用质粒提取盒提取质粒；取重组质粒作模板，用EcoRΙ和Hind III对重组质粒进行双酶切和核酸电泳；将酶切鉴定鉴定为阳性的重组质粒送检测序，把构建正确的重组原核表达质粒命名为pET-32a(+)-MS-eLPD；将重组质粒pET-32a(+)-MS-eLPD转化BL21，培养过夜后挑取单个分散的菌落在LB液体培养基继续培养，IPTG诱导蛋白的表达，纯化获得鸡滑液囊支原体抗原蛋白MS-eLPD，鸡滑液囊支原体抗原蛋白MS-eLPD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子量为54KDa。

本发明进一步提供了鸡滑液囊支原体抗原蛋白MS-eLPD在制备鸡滑液支原体间接ELISA检测试剂盒的应用。