[发明专利]BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用

权利要求书

1.BsER烯还原酶，其特征在于，所述BsER烯还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述BsER烯还原酶为通过NCBI数据库基因挖掘得到，来自枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的BsER烯还原酶，其特征在于，以所述的BsER烯还原酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1作为模板，进行定点突变，得到烯还原酶突变体；所述的烯还原酶突变体的氨基酸序列的突变位点包括第30位、第32位、第72位、第106位、第233位和第262位，其中，第30位突变为A/V/S/C/G，第32位突变为A/V/S/C/G/I/L，第72位突变为A/V/S/C/G/Y/W，第106位突变为A/V，第233位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y，第262位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y；其中烯还原酶突变体的氨基酸序列和核酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.86。

3.根据权利要求1或2所述的BsER烯还原酶，其特征在于，所述BsER烯还原酶及烯还原酶突变体的构建，具体步骤如下：

(1)将来源于枯草芽孢杆菌的BsER烯还原酶经基因克隆后连入表达质粒pET28b_NhisMBP上，将连有烯还原酶目的基因的重组质粒转到感受态细胞E.coli Rosetta2(DE3)中，得到重组工程菌；

(2)阳性克隆筛选：将重组工程菌划线到含有卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养；挑单克隆菌株的一半进行菌落PCR验证条带大小是否与目的基因一致；

(3)菌种培养及表达：挑适量单克隆菌株于4mL LB液体培养基中过夜培养，后转接到100mL LB液体培养基中，37℃震荡扩大培养，OD600数值达到0.6时加入IPTG在15-30℃低温诱导表达培养12h，得到菌液。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的BsER烯还原酶，其特征在于，所述的BsER烯还原酶及烯还原酶突变体的应用，具体为：将含有BsER烯还原酶及烯还原酶突变体编码基因的大肠杆菌工程菌，经发酵培养表达后收集得到的菌体；将上述菌体经超声破碎后，进行离心提取，得到粗酶液；以粗酶液为生物催化剂，在KH₂PO₄和K₂HPO₄缓冲体系下进行反应，得到反应液；将反应液进行萃取，得到产物。

5.根据权利要求4所述的BsER烯还原酶，其特征在于，所述离心提取的转数为12000rpm/min；所述缓冲体系的pH＝7；所述进行反应具体为，在30-37℃，100-300rpm震荡条件下反应12-24h；所述进行萃取具体为，用乙酸乙酯进行萃取，所述反应液与乙酸乙酯的体积比为1：1。

6.根据权利要求4或5所述的BsER烯还原酶，其特征在于，以rac-1a为底物，获得光学纯(R)-1a底物剩余和cis-2a主要产物；以rac-1b为底物，获得光学纯(R)-1b底物剩余和cis-2b主要产物；以(1S,7aS)-3a为底物，获得烯还原产物(1S,3aR,7aS)-4a；以(1S,8aS)-3b为底物，获得烯还原产物(1S,4aR,8aS)-4b。

7.根据权利要求6所述的BsER烯还原酶，其特征在于，对于底物rac-1a的酶催化，获得烯还原酶突变体优选为T30S/F72W，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；对于底物rac-1b的酶催化，获得烯还原酶突变体优选为F72A/T30A，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

8.根据权利要求6所述的BsER烯还原酶，其特征在于，对于底物(1S,7aS)-3a的烯还原催化，得到烯还原酶突变体优选为F72W，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；对于底物(1S,8aS)-3b的烯还原催化，得到烯还原酶突变体优选为F72W/E233G，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。