[发明专利]一种编码右旋糖酐蔗糖酶的基因及其应用

说明书

本发明公开了一种右旋糖酐蔗糖酶基因及其应用，所述基因为基因dsrA，包括SEQ ID NO.1核苷酸序列序列，所述基因所编码的蛋白质，包括SEQ ID NO.2氨基酸序列。所述基因来源于肠膜状明串珠菌的右旋糖酐蔗糖酶基因，是通过设计引物从肠膜状明串珠菌基因组中克隆得到的右旋糖酐蔗糖酶基因。该基因编码的蛋白质可用于制备右旋糖酐、低聚糖或果糖。本发明通过分析该酶的氨基酸组成，通过同源建模的方法获得了该酶的三维结构，从而为对该右旋糖酐蔗糖酶的分子改造以提高其活性和稳定性，为其工业化生产和应用提供技术支持。

技术领域

本本发明属于生物技术领域，具体涉及一种右旋糖酐蔗糖酶基因及其应用，该基因编码的蛋白质可用于制备右旋糖酐、低聚糖或果糖。

背景技术

右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，EC 2.4.1.5)，又称葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrase)，或称为葡糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)，它是属于糖类水解酶第70(GH70)家族的糖苷转移酶，在只有蔗糖存在的情况下，该酶能催化蔗糖分子上的葡萄糖苷合成高分子量的葡萄基聚合物即右旋糖酐(又称α-葡聚糖，α-Glucan)，同时有果糖副产物的生成。右旋糖酐主链以α-D-1，6糖苷键连接，侧链分支点是由α-D-1，3和α-D-1，2连接，是最早发现的微生物多糖，也是较早作为代血浆应用的微生物多糖，右旋糖酐及其衍生物有重要的生物学功能而有广阔的市场前景和开发价值。当有可识别的外源受体存在时，该酶能将葡糖基转移给外源受体从而合成低分子量的低聚糖。低聚糖一般由2-10个单糖构成的短链糖类聚合物，其分子量在300-2000Da之间。研究表明，在不同受体分子作用下右旋糖酐蔗糖酶均会同时催化两种转糖基反应，即受体反应与多糖链延伸反应，聚合成两种分子量差异极大的产物即右旋糖酐和低聚糖。在蔗糖溶液中添加麦芽糖或异麦芽糖的情况下，葡萄糖残基不再被转移到葡聚糖上而被转移到受体的非还原端，受体反应产物分子亦可做为葡萄糖基的受体，从而形成不同聚合度的低聚糖，同时伴有果糖的生成。因此，小分子糖类受体的加入可以在一定程度上实现低聚糖的定向制备。低聚糖不能被人体的消化道酶及人体胃酸降解，能够增加肠胃中益生菌的数量，其甜度低，热量低，基本上不增加血糖和血脂，还有抑病原菌和增强免疫力等保健作用，是重要的功能食品。

右旋糖酐蔗糖酶反应的特异性、产物的多样性以及对于产物合成的可操作性而使其成为生物催化合成中一种重要的工具酶。右旋糖酐蔗糖酶甚至可以直接加入发酵食品中改变产品的质地，其得到的主要产物即右旋糖酐及其衍生物或低聚糖，在医药、精细化工、石油开采、食品、材料和化妆品等领域等有广泛的应用前景，可见右旋糖酐蔗糖酶在酶法合成右旋糖酐、低聚糖和果糖工业化生产中有重要的地位。

目前，已有多个不同来源的右旋糖酐蔗糖酶相关基因被克隆和测序，及其相关酶学性质在国内外均有研究，由于酶的来源不同，其相关编码的基因有所不同，酶本身的功能特性、催化程度的差异性，其可以转化蔗糖合成糖苷键种类和含量不同、分子量大小不同的右旋糖酐或低聚糖，相对分子质量从3×10²～3×10⁸Da不等。目前，国内制备不同分子量标准右旋糖酐或低聚糖通常是通过肠膜状明串珠菌发酵蔗糖为主要手段，后经相关处理得到相应分子量的产品。从1957年开始，中国医学科学院输血及血液学研究所对国产右旋糖酐进行了较为系统的研究，选出了高产右旋糖酐的菌种1226号肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides，L-M-1226)，该菌由于制备的右旋糖酐其α-D-1，6糖苷键在95％左右，产物溶解性好等优点于上世纪60年代已向全国推广。按《中国药典》2020年版标准要求，国内制备商品化的右旋糖酐20(T20)、40(T40)、70(T70)，是以蔗糖为底物经肠膜状明串珠菌L-M-1226发酵后生成高分子葡聚糖聚合物，经处理后精制而得的，肠膜状明串珠菌L-M-1226(现编号：L-M-CMCC(B)34991)是国内制备右旋糖酐或低聚糖的模式菌株，2021年中国食品药品检定研究院王珊珊等对肠膜状明串珠菌L-M-CMCC(B)34991进行了全基因组测序(中国生物制品学杂志，2021,34(06):666-670+677)，但没有对相关右旋糖酐蔗糖酶基因进行注释。