[发明专利]检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合及试剂盒

权利要求书

1.一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感三价DNA疫苗中单个质粒含量的引物和探针组合，其特征在于，包括SEQ ID No.1~SEQ ID No.6所示核苷酸序列的引物及SEQ IDNo.7~SEQ ID No.9所示核苷酸序列的TaqMan探针。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1或MGB。

3.一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品。

5.一种基于TaqMan荧光定量PCR检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中单个质粒含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以pH5-FJ（H5-Re13）株、pH5-SX（H5-Re14）株和pH7-YN（H7-Re4）株三种质粒的标准品为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR，建立标准曲线；

（2）取待检测禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗成品或其稀释后的使用液作为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行荧光定量PCR；

（3）对比各个质粒的标准曲线，计算出禽流感（H5+H7）三价DNA疫苗中各个质粒的拷贝数。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的体系为：

RT-PCR酶                               10µl，

无RNA酶H₂O                             7µl，

10pmol上游引物                         0.4µl，

10pmol下游引物                         0.4µl，

10pmol探针                             0.2µl，

模板                                   2µl。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：37℃污染消化2分钟；95℃预变性5分钟；95℃变性10秒，60℃退火30秒，共30个循环，在每一退火步骤结束时收集FAM荧光信号。