[发明专利]柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法。针对目前对柔嫩艾美耳球虫耐药性的鉴定只有体内方法，耗时长，成本高，效率低下等问题，本发明提供了一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法，通过分离鉴定养殖场的柔嫩艾美耳球虫，制备柔嫩艾美耳球虫子孢子，采用MDBK细胞复苏、传代和毒性检测，确定药物最小抗球虫浓度，在最小抗球虫浓度的药物下进行繁殖抑制实验，计算相对繁殖抑制率并评价耐药性等步骤。本发明的体外鉴定鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的方法尚属首创，该方法不仅建立了球虫子孢子的制备方法，还确定了体外耐药性的评价标准，该方法简单高效，安全可靠，具有很好的实际应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法。

背景技术

鸡球虫病是由顶复门原虫艾美耳属球虫(Eimeria)寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病，对全球的养鸡业造成巨大的经济损失。至今，我国公认的鸡艾美耳球虫有7种，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)致病性最强，危害最为严重。在养鸡生产中，由于球虫疫苗使用效果的稳定性差、存在弱毒返祖等原因，目前药物防控仍然是控制鸡球虫病的主要措施，但是现有的药物由于耐药虫株的产生，面临治疗效果下降甚至失效的风险，使得鸡球虫病成为制约养鸡业健康发展的关键因素之一。

自90年代起，鸡球虫产生的抗药性问题引起了国内学者的广泛关注，已有大量学者针对不同种类球虫对不同药物的耐药性进行了研究，但目前的耐药性研究都需要建立感染球虫的动物模型，实验周期长，成本高，在养殖场遭遇感染时，无法快速高效的筛选到不耐药的药物，影响预防和治疗效果。目前，还未见有通过体外实验对鸡球虫耐药性进行鉴定的方法，亟待开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：目前对柔嫩艾美耳球虫耐药性的鉴定只有体内方法，耗时长，成本高，效率低下等问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种柔嫩艾美耳球虫耐药性的体外鉴定方法。该方法包括以下步骤：

a、柔嫩艾美耳球虫的鉴定及分离

在养殖场取混合虫株，进行虫种鉴定，确认混合虫株中存在柔嫩艾美耳球虫；通过单卵囊分离技术，分离得到柔嫩艾美耳球虫；

b、制备柔嫩艾美耳球虫子孢子

将步骤a得到的柔嫩艾美耳球虫离心，弃上清，加入PBS重悬后反复离心至上清液澄清，采用次氯酸钠重悬沉淀，孵育8-12min，再次离心；再采用PBS重悬去除次氯酸钠；将沉淀中加入PBS，进行涡旋，每次涡旋10-20s，重复涡旋3-5次，待孢子囊-卵囊比率大于90％时，停止涡旋；将涡旋后的上清液采用PBS洗涤2-3次，将孢子囊离心，弃上清，将沉淀的孢子囊与胰蛋白酶和鸡胆汁在PBS中混合，在40-41℃下孵育60-120min，每30min监测一次脱囊率，孵育完成后，将游离的子孢子转移到40-41℃的葡萄糖中，用安装在无菌连接环上的5-μm过滤器通过真空过滤纯化子孢子；然后再离心，洗涤，得到游离子孢子，培养于含有5-10％新生牛血清的DMEM细胞培养基中；

c、MDBK细胞复苏、传代

取出MDBK冻存管，水浴解冻，离心，弃上清，沉淀转入DMEM培养基中培养，待细胞生长至80-90％时，进行细胞传代；

采用PBS缓冲液清洗细胞瓶2-3次，采用胰蛋白酶消化细胞2-5分钟，当80％以上细胞被消化时，反复吹打细胞，将细胞转移至离心管中离心，弃上清，将细胞在DMEM培养基培养；

d、MDBK细胞毒性检测

使用MTT试剂盒进行细胞毒性检测，确定药物的CC50值；

e、筛选确定药物的最小抗球虫浓度；