[发明专利]一种鼠三毛滴虫可视化LFD-RPA试剂盒及制备方法

说明书

本发明公开一种鼠三毛滴虫可视化LFD‑RPA试剂盒及制备方法，以鼠三毛滴虫16S rRNA基因为靶基因，设计并筛选特异性引物及探针，建立鼠三毛滴虫LFD‑RPA的可视化快速核酸检测方法，RPA等温扩增原理结合侧流层析试纸条建立鼠三毛滴虫感染核酸检测技术，建立了一种检测鼠三毛滴虫的可视化快速敏感方法，不依赖大型仪器，实现快速、易操作的检测。

技术领域

本发明公开一种鼠三毛滴虫LFD-RPA试剂盒及制备方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

鼠三毛滴虫（ Tritrichomonasmuris）是原生动物门、鞭毛纲、毛滴虫目的一种毛滴虫，可感染小鼠等啮齿类动物，在小白鼠、豚鼠、沙鼠等实验动物中较为常见，主要寄生在盲肠内。近年来发现感染鼠三毛滴虫后可引起结肠炎，甚至是结肠癌的出现。在小鼠等实验动物中，鼠三毛滴虫存在的情况较为普遍，不仅影响实验动物的质量，在一定程度上也对实验结果造成影响。《实验动物寄生虫学等级及监测》规定：无特定病原体(specific pathogenfree,SPF)级的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠作为实验动物时体内不得携带鞭毛虫及纤毛虫。因此，正式开展实验前，对实验动物体内鼠三毛滴虫感染的监测尤为重要。

目前诊断鼠三毛滴虫感染的方法主要为镜检，但镜检法检出率不高，存在漏检的可能。且未见针对鼠三毛滴虫进行检测的试剂盒及方法，而重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)的快速诊断方法可以结合镜检法进行确诊，这大大提高了检测的效率及准确度。重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(LFD-RPA)是RPA技术结合侧流层析试纸条(Lateralflowdipsticks，LFD)建立的一种现场快速检测系统，可在试纸条上快速直观的观察检测结果，提高检测效率，缩短检测时间。

发明内容

本发明提供一种鼠三毛滴虫LFD-RPA的可视化快速核酸检测试剂盒的制备，以鼠三毛滴虫16S rRNA基因为靶基因，设计并筛选特异性引物及探针，建立鼠三毛滴虫LFD-RPA的可视化快速核酸检测方法，用于检测鼠三毛滴虫的感染。

本发明所述的一种鼠三毛滴虫LFD-RPA的可视化快速核酸检测试剂盒，其特征在于：

1）试剂盒中包括含RPA冻干颗粒的反应管、反应缓冲液A Buffer、扩增试剂BBuffer、上下游引物和探针以及ddH₂O和侧流层析试纸条；

试剂盒中还包含：阳性对照的DNA 模板为感染鼠三毛滴虫粪便基因组DNA；阴性对照的为未感染鼠三毛滴虫粪便基因组DNA，用于比较RPA产物以及监测RPA操作过程是否有污染；

所述试剂盒25μL反应体系如下：12.25μL的A Buffer，2μM上下游引物各1μL，2μM探针0.3μL，ddH₂O 6.45μL，鼠三毛滴虫DNA模板2.5μL及1.25μL的B Buffer；

所述RPA冻干颗粒反应管的组分包括：重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶；

1）RPA反应液：A Buffer12.25μL；DNA模板2.5μL；B Buffer1.25μL；2μM上游引物、2μM下游引物各1μL；2μM探针0.3μL；加双蒸水25μL；

2）对照：阳性对照的DNA 模板为感染鼠三毛滴虫粪便基因组DNA；阴性对照的为未感染鼠三毛滴虫粪便基因组DNA，用于比较RPA产物以及监测RPA操作过程是否有污染；

3）所述试剂盒还包括侧流层析试纸条；

所述的引物为：

上游引物：5'-CTTTTGGGGTATTTGTATAGGATCGCACTT -3'；

下游引物：5'-Biotin-GACAGGCAATTCTGACTACGAGCGTTTTAA -3；

探针为：