[发明专利]一种单酶法分步合成分子量可控右旋糖酐方法及其应用

说明书

本发明公开一种单酶法分步合成分子量可控右旋糖酐方法及其应用，通过添加前体控制分子量合成得到右旋糖酐产品，其产品种类包括右旋糖酐T70，右旋糖酐T40，右旋糖酐T20和右旋糖酐T10，其步骤分为三大步骤：步骤（1）以麦芽糖或低聚异麦芽糖为受体加入右旋糖酐蔗糖酶和蔗糖制备，或者通过膜分离制备得到小于目的右旋糖酐重均分子量的右旋糖酐作为前体；步骤（2）在蔗糖溶液中，加入步骤（1）制备得到的前体，再加入右旋糖酐蔗糖酶进行合成转化；步骤（3）对步骤(2)所得含右旋糖酐溶液进行纯化，先经过除杂，然后进行两级膜分离和喷雾干燥或采用乙醇沉淀分离再干燥得到目的重均分子量右旋糖酐。相比传统方法，本发明通过自行制备前体，降低前体投入成本；添加前体的单酶法合成右旋糖酐，大幅度提高目的右旋糖酐的比例，可只需两级膜分离纯化得到右旋糖酐，工艺更简便，分子量控制工艺简单，提高产品合成浓度和品质，降低生产成本低，工艺更加绿色和环保。

技术领域

本发明涉及生物技术的酶催化技术领域，具体涉及一种单酶法分步合成分子量可控右旋糖酐方法及其应用。

背景技术

医药级右旋糖酐是由明串珠菌右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，EC 2.4.1.5）转化蔗糖得到的葡聚糖，其α-1，6键的比例通常在95%左右，亲水性好，易溶于热水。右旋糖酐T70、右旋糖酐T40、右旋糖酐T20在临床医疗上具有重要作用，而右旋糖酐T10可用于制备右旋糖酐铁等衍生物。

传统右旋糖酐生产是在含蔗糖培养基中接种肠膜状明串珠菌，发酵培养得到大分子右旋糖酐，以较低浓度的乙醇把大分子的右旋糖酐沉淀，通过捏洗除去大部分菌体和蛋白。或者发酵得到的粘度很高的右旋糖酐先加水稀释，从板框过滤除去大部分菌体，再加乙醇进行沉淀。由于菌体、蛋白等杂质混在右旋糖酐中，难以分离，所制备的右旋糖酐容易带入引起过敏、发热的杂质。直接用乙醇沉淀会残留比较多的菌体和蛋白，而先稀释过滤可以除去更多菌体和蛋白，但又会增加乙醇的用量。由蔗糖转化为右旋糖酐的理论转化率是47.37%。传统工艺下，右旋糖酐蔗糖酶与合成的右旋糖酐结合紧密，合成得到1000kDa以上大分子右旋糖酐。当蔗糖转化率达到85%以上时，色谱检测，大分子右旋糖酐的比例通常高于35%，仅有少量分子量低于100kDa的小分子右旋糖酐。传统工艺直接合成大分子右旋糖酐，因大分子右旋糖酐亲水性好，粘度高，影响酶与蔗糖的传质反应，所以蔗糖的最佳反应浓度不高，一般采用13%的蔗糖浓度，转化所得右旋糖酐浓度6%以内。要得到医用右旋糖酐，一般需要对大分子右旋糖酐用酸水解或右旋糖酐酶水解。但水解产物往往分布较宽，产物不集中，需要进行复杂的乙醇沉淀分离，分别划分得到右旋糖酐T70、右旋糖酐T40和右旋糖酐T20，以及更小的右旋糖酐T10，右旋糖酐T5等；或者通过多级膜分离水解产物获得各种糖酐。

专利CN103266146B报道一种双酶固定化耦合多级膜分离制备药用右旋糖酐和果糖的方法，通过酶膜耦合的方法控制右旋糖酐转化合成和分离，得到多种分子量大小的右旋糖酐，其转化设备和工艺复杂，需要多级分离，才能把转化液中的右旋糖酐分离出来，效率不高。要把多级膜分离简化为最多两级膜分离，要求膜处理前的右旋糖酐分布集中在目的右旋糖酐种类上，如右旋糖酐T20或右旋糖酐T40等，才能通过一到两次膜分离得到分子量限度符合要求的右旋糖酐，如文献《两级膜超滤纯化右旋糖酐的工艺研究》报导的研究结果。