[发明专利]一种原代脂肪细胞和脂肪干细胞的提取方法

说明书

一种原代脂肪细胞和脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤：开腹手术患者取得组织，然后清洗组织：仅留黄色的脂肪团块，直至冲洗液无明显血迹；剪碎组织至呈稀糊状，向剪碎的脂肪组织中加入消化酶缓冲液进行消化，将脂肪消化液置于离心机中离心，将上层油脂用移液枪弃去，取中间黄色脂肪层洗涤离心去上层油脂，过滤后继续离心并去除上层油脂即可得到脂肪细胞并可继续培养，弃上清并留取脂肪干细胞层，加红细胞裂解液，裂解后离心，弃上清再清洗离心，用滤网过滤后，收集滤液于培养瓶中培养，该方法通过消化酶缓冲液可同时提取组织组织中的原代脂肪细胞和脂肪干细胞，提高了提取速度，节约了脂肪组织和试剂耗材的用量。

技术领域

本发明涉及一种原代脂肪细胞和脂肪干细胞的提取方法。

背景技术

脂肪组织在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用被认为是一个内分泌器官。脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，被疏松结缔组织分割成脂肪小叶。脂肪组织除脂肪细胞外，包含细胞的基质血管部分(Stromal Vascular Fraction，SVF)，包括脂肪干细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和多种免疫细胞。脂肪组织病理性改变是糖尿病、高血压、高血脂、脂肪肝、心血管疾病和炎症等疾病的重要影响因素。因此，原代脂肪细胞和脂肪干细胞提取和培养在研究相关疾病等发病机制中具有很重要的研究价值。然而目前的提取方法是将原代脂肪细胞和脂肪干细胞提取的方法均是单独进行的，存在耗时、浪费和功能单一等确定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种原代脂肪细胞和脂肪干细胞的提取方法，该方法通过消化酶缓冲液可同时提取组织组织中的原代脂肪细胞和脂肪干细胞，提高了提取速度，节约了脂肪组织和试剂耗材的用量。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种原代脂肪细胞和脂肪干细胞的提取方法，包括以下步骤：

(1)标本获取：从开腹手术患者取得新鲜网膜组织，立即装于无菌手套中密封转移至实验室细胞房，整个过程控制在20min以内；

(2)清洗组织：用75％医用酒精消毒无菌手套外部后将手套放于超净台中，用无菌剪刀在超净台中剪开手套，使用无菌镊子将脂肪组织放入培养皿中，之后用含有4％青链霉素的Hanks缓冲液仔细清洗脂肪组织，用剪刀和镊子剔除肉眼可见的红色血管和白色纤维组织，仅留黄色的脂肪团块，再用Hanks液清洗2-3遍，直至冲洗液无明显血迹；

(3)剪碎组织：用眼科剪剪碎脂肪组织，至呈稀糊状，剪碎的脂肪组织大小为1mm³；

(4)消化：将剪碎的脂肪组织转移至50mL离心管中，加入提前无菌过滤后的消化酶缓冲液，置于37℃恒温水浴箱中反复振荡1h，直至试管中无明显脂肪块，得到脂肪消化液，所述的消化酶缓冲液添加量为脂肪组织体积的两倍，消化酶缓冲液的组成为：每100mLHanks液中含有3g的BSA、0.8g的胶原酶和0.48g的Dispase II，震荡速度为150次/min；

(5)离心：将脂肪消化液置于离心机中，以2000rpm离心5min，离心后脂肪组织分离为3层，最上层为透明油脂层，中间为黄色脂肪细胞层，底部沉淀为脂肪干细胞层；

(6)过滤纯化培养：

a、脂肪细胞：将上层油脂用移液枪弃去，把中间黄色脂肪层转移至新的50mL第一离心管中，按体积比1:1的比例加入无菌Hanks液清洗，混匀后放入离心机，以2000rpm离心5min，仍可见分层现象，同样用移液枪弃去上层油脂，将提前准备好的无菌滤网置于培养皿上，用移液枪把黄色脂肪层转移至滤网上，轻轻搅动使脂肪细胞穿过滤网，收集培养皿中滤过的脂肪细胞原液，将脂肪细胞原液转移至新的50mL第二离心管中，以2500rpm离心5min，用移液枪吸净上层油脂，再将中间黄色的脂肪细胞转移至新的第三离心管中；将培养瓶中装满脂肪细胞培养基，然后加入2mL脂肪细胞，将培养瓶以倒置的方式放在温箱中，用天花板培养法进行培养，所述的脂肪细胞培养基的组成为：DMEM/F12培养基500mL+胎牛血清55mL+青霉素链霉素混合液5.5mL；