[发明专利]一种粪便核酸提取预处理液、预处理方法、试剂盒与应用

说明书

本申请公开了一种粪便核酸提取预处理液、预处理方法、试剂盒与应用，所述一种粪便核酸提取预处理液包括预处理液A和预处理液B；所述预处理液A包括NaHCO₃和/或Na₂CO₃、盐酸胍和/或异硫氰酸胍以及非离子表面活性剂；所述预处理液B包括Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝剂、pH调节剂，同时，本申请还公开了一种粪便核酸提取的预处理方法和一种粪便核酸提取试剂盒。本申请的优点在于，所述一种粪便核酸提取预处理液具有提取纯度高，提取速度快，成本低，提取过程中不会产生气溶胶污染，不会破坏ddPCR液滴的优势，所述核酸提取试剂盒具有提取耗时短，产物纯度高，操作简便，可用于ddPCR检测等优势。

技术领域

本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种粪便核酸提取预处理液、预处理方法、试剂盒与应用。

背景技术

目前粪便核酸提取主要有离心取上清水煮法、研磨+柱提法、蛋白酶K+磁珠法等方法。其中，离心取上清水煮法存在检测精确度不高的现象，其原因在于，在使用离心取上清水煮法进行核酸提取时，细菌及细胞离心后大部分都被沉淀，上清液含量较少；并且此方法需要加热，容易导致气溶胶污染，存在提取产物中PCR抑制物质较多，所提取的核酸纯度不高，并且易出现假阴性漏检等情况，从而影响整个检测的准确性和灵敏性；

研磨+柱提法存在提取时间长，操作过程复杂，成本较高，费时费力等情况；

蛋白酶K+磁珠法存在提取时间长，并且提取时需要蛋白酶K，并且此方法需要对样本进行加热，容易导致气溶胶污染；存在提取产物中PCR抑制物质较多，导致检测结果出现假阴性和漏检，从而影响整个检测的准确性和灵敏度。

发明内容

为了解决上述至少一种技术问题，开发一种提取纯度高、成本低、操作简单、耗时短、可直接应用ddPCR检测的核酸提取方法，本申请提供一种粪便核酸提取预处理液、预处理方法、试剂盒与应用。

第一方面，本申请提供一种粪便核酸提取预处理液，所述预处理液包括预处理液A和预处理液B；

所述预处理液A包括NaHCO₃和/或Na₂CO₃、盐酸胍和/或异硫氰酸胍以及非离子表面活性剂；其中，所述NaHCO₃和/或Na₂CO₃质量分数为1～10％，所述盐酸胍和/或异硫氰酸胍浓度为0.2～8.0mol/L；所述预处理液A的pH值为7.0～12.0；

所述预处理液B包括Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝剂和pH调节剂；其中，所述Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝剂质量分数为1％～10％；所述预处理液B的pH值为3.0～7.0。

通过采用上述技术方案，本申请解决了现有技术中存在的核酸纯度不高、核酸提取操作复杂、耗时长等问题。其机理在于，所述盐酸胍和/或异硫氰酸胍对粪便样本细胞进行破裂、抑制核酸酶的活性、保护核酸不被降解；所述非离子表面活性剂能够辅助细胞的裂解，从而提高细胞裂解效率；所述Al³⁺和/或Fe³⁺絮凝剂与预处理液A中的NaHCO₃和/或Na₂CO₃水解出的OH-在碱性环境下，会生成Al(OH)₃沉淀，在沉淀的生成过程中会与粪便样本中的颗粒进行电中和脱稳、压缩双电层，具有吸附架桥或粘附卷扫和沉淀物网捕等作用，从而生成粗大絮凝体，沉淀PCR抑制物质。

因此，本申请提供的粪便核酸提取预处理液在对粪便样本进行预处理时，不需要酶的加入就可实现对粪便样本的预处理，并且，本申请提供的粪便核酸提取预处理液，不仅具有能够彻底处理粪便中杂质的优点，同时具备所提取的核酸纯度高、预处理所需时间较短等优势。

可选的，所述预处理液A还包括EDTA-2Na以及聚乙烯吡咯烷酮K30和/或聚乙烯吡咯烷酮K90；