[发明专利]一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法

说明书

本发明公布了一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，包括以下步骤：①配置液体培养基；②带菌枝条消毒；③在灭菌试管中装入2ml步骤①配制的液体培养基，将步骤②获得的灭菌枝条放置于灭菌试管中，光照强度为1600‑2200Lux，25℃16小时光照/8小时黑暗条件下培养，10‑15天后陆续长出新芽；④配制诱变液体培养基；⑤获得诱变茎尖生长点；⑥获得消毒砧木种子；⑦将消毒砧木种子接种到MS固体培养基中，暗培养13～15天，获得高度为6～9cm的黄化小苗；⑧获得嫁接苗；⑨将嫁接苗置于培养箱中，暗培养，至待接穗芽长至0.5～1cm时，再二次嫁接于温室。本发明因为使用成年态茎尖进行化学诱变，避开了果树童期，大大缩短育种进程。

技术领域

本发明属于生物技术研发技术领域，尤其是涉及一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法。

背景技术

柑橘类果树不仅品种间容易杂交，而且种间以及柑橘属与其近缘属之间都能杂交，其杂交第一代即有较大的分离。因此，杂交育种在柑橘育种中占有最重要的地位。在90多年的世界柑橘杂交育种史上，已培育出了众多的新品种。传统杂交柑橘的育种周期长，其主要原因就是柑橘童期漫长。柑橘童期是指柑橘从种子播种到开花所经历的时间年数。通常情况下，杂交后代柑橘种子播种后，要到第7年或第8年才开始开花，即柑橘的童期要7、8年，加上后续性状观察与遗传稳定性鉴定，育成一个杂交柑橘品种平均要耗时18年多。这一特性严重阻碍柑橘育种工作效率，也致使柑橘成为杂交育种周期最长的果树之一。因此，避开柑橘童期的研究成为提高柑橘育种工作效率的关键所在。

芽变选种也是培育柑橘新品种的重要方法之一，简单、见效快，易被人们掌握。

芽变是柑橘体细胞突变的一种，突变发生在芽的分生组织中，当芽萌发长成枝条，性状表现与原品种有质的差异，即为芽变。变异芽萌发成枝称枝变，把枝变的芽培养成一个一个新品种的方法称为芽变选种。

柑橘是产生自然突变（芽变）频率较高的果树，每500个侧枝中就有一个枝变，但优良变异的频率低得多。芽变选种是在生产园中选取三年生以上丰产稳产的结果柑橘树，经三年的观察、鉴定，并将结果记录归档。初选优良单株经过高接鉴定，观察其性状的稳定性，再进入选种圃，做全面综合性鉴定，同时开展区域性鉴定。可见，自然芽变选种劳动力成本和经济成本均很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法。该方法大大缩短了育种进程。

为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案是：

一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，包括以下步骤：

①配置液体培养基: 在MS液体培养基中加入抗生素母液，抗生素母液的工作浓度为50 μg/ml；-20℃保存备用；

②带菌枝条消毒：选取外观无明显病斑，长势较好的需要脱除病菌柑橘成年树枝条，制成外植体，消毒15-25分钟，无菌水冲洗4-5次，获得灭菌枝条；

③在灭菌试管中装入2ml 步骤①配制的液体培养基，将步骤②获得的灭菌枝条放置于灭菌试管中，在光照强度为1600-2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下培养，10-15天后陆续长出新芽；

④配制诱变液体培养基：将MT液体培养基与EMS液体培养基混合，配制成诱变液体培养基；

⑤茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，对长出新芽的枝条进行剥取，获得长度为0.4-0.6mm的茎尖生长点；将茎尖生长点接种于2-3ml诱变液体培养基中，室温放置，获得诱变茎生长点；采用本申请的液体诱变培养基有利于增加茎尖生长点的存活率。本申请采用0.4-0.6mm的茎尖生长点，是因为如果茎尖生长点超过0.6mm，不利于进行微芽嫁接的操作，因为黄化苗直径有限。但是如果茎尖生长点小于0.4mm，茎尖存活率会显著下降。

⑥选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，消毒，用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；