[发明专利]转基因大豆事件JK1001-2及其检测方法

说明书

本发明提供一种核酸序列，其包含选自序列SEQ ID NO:1‑7或其互补序列中的一种或多种，所述核酸序列来源于转基因大豆事件JK1001‑2，包含所述事件的种子的代表性样本已以保藏编号CCTCC NO:P202333保藏。本发明的转基因大豆事件JK1001‑2具有如下优点：含人乳铁蛋白基因并可稳定表达人乳铁蛋白；耐受常用商业化除草剂草甘膦；不降低大豆产量；能够用分子标记来追踪繁殖群体及其子代中的转基因插入片段。同时本发明提供的检测方法能够快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因大豆事件JK1001‑2植物材料的存在。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及含人乳铁蛋白基因及对耐受草甘膦除草剂施用的转基因大豆事件JK1001-2和用于检测转基因大豆JK1001-2的核酸序列及方法。

背景技术

乳铁蛋白是广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中的蛋白，最早于1939年在牛奶中发现，并于1960年从牛奶和人乳汁中被分离。在人体中，初乳中含量最高，达8mg/ml，在乳汁中为1.5-4mg/ml,在泪液中为2mg/ml，在其他分泌物（如唾液、关节液、血浆）中含量较低，一般低于0.01mg/ml。其被认为与铁转运和储存相关，属于乳转铁蛋白（Lactotransferrin）家族。乳铁蛋白序列在人、牛、鼠、猪等物种当中高度保守，为约690个氨基酸残基的糖蛋白，分子量约76-81kDa。在三维结构上，乳铁蛋白包含N-和C-两个小叶（lobe），每个小叶在两个结构域之间的深裂隙中能够结合一个单独的Fe³⁺离子。

在消化道中，乳铁蛋白会被水解成为具有生理功能的小肽——乳铁蛋白活性多肽（LFcin B），它是含有25个氨基酸的多肽，具有强碱性（pH8.15），其水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道中不易降解、调节免疫活动、广谱抑菌等特性。这也是口服乳铁蛋白发挥活性的基础。迄今为止，乳铁蛋白的研究开发与应用已成为科学研究的重点，现有研究表明，乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌、免疫调节、促进骨骼生成、调节肠道菌群等活性，其在疾病预防、辅助治疗等方向上得到广泛应用。

目前乳铁蛋白的制备主要依赖于从牛奶中提取，例如飞鹤集团应用先进的层析超滤技术,实现了乳铁蛋白的提取，建成了行业内第一条乳铁蛋白自动化生产线。然而从牛奶中提取乳铁蛋白，具有动物病原污染的风险，此外乳铁蛋白的天然含量不足，约14kg牛奶中仅能提取1g蛋白，这都限制了从牛奶中大量制备乳铁蛋白，也使得乳铁蛋白的价格高达7000~8000元/kg。

为了大量生产乳铁蛋白，目前，已经有在大肠杆菌、毕赤酵母、小鼠、奶牛、马铃薯和大米中表达乳铁蛋白的成功案例，然而通过原核生物表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具有生物活性。以酵母或动物细胞培养来表达这些蛋白不仅成本高而且条件要求高。

植物果实或种子具有较强的蛋白合成功能，若能以转基因植物来表达乳铁蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高、成本低而且简单易行。但是现有技术中很少有人利用植物尤其是大豆来大量生产乳铁蛋白。

大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)在世界上很多地区都是重要的粮食作物及油料作物。生物技术已经应用于大豆以改善其农艺性状和品质。在大豆生产中一个重要的农艺性状是除草剂耐受性，特别是耐受草甘膦除草剂。大豆对草甘膦除草剂的耐受性可以通过转基因的方法使草甘膦除草剂耐受型基因(epsps)在大豆植物中表达而获得。