[其他]牛焦虫疫苗制造方法

说明书

本发明涉及生产牛焦虫疫苗的方法，特别是涉及 以高速转动培养技术生产牛焦虫疫苗的方法。

牛焦虫病是一种寄生虫病，主要分布在亚洲、非 洲、欧洲三十多个国家，世界上十亿头牛中，约有四分 之一的牛可能受到蜱的叮咬而受到血液原虫的传染， 每年因各种泰勒焦虫病死亡数十万头，因此，牛焦虫 病引 起了有关国家的高度重视。研究牛焦虫疫苗较 早的国家有以色列、印度、土耳其，但它们都处于试验 室试验阶段。检索的苏联莫斯科库兹明克兽医试验 研究所在英国申请的专利(专利号2050161A，申请 日1979年6月4日，公布日1981年1月7日)，也处 于实验室静止单层培养阶段，由于数量质量等原因不 能用于病区防疫。我国在牛焦虫疫苗的研究方面，已 经投入批量生产，广泛用于牛焦虫病的防预。国内开 展这项研究工作较早的是中国农科院兰州兽医研究 所，其研究结果，在《中国农业科学》1982年第四期 88-95页上已发表。本发明人在中国农科院兰州 兽医研究所的基础上进行了中间扩大试验研究，把静 止单层培养改为转动培养，从而使牛环形泰勒焦虫裂 殖体胶冻细胞疫苗的制造由实验室小批生产阶段转 入生药厂大批生产阶段。其静止培养和低转速培养 (6周/小时)生产过程中都是将悬浮细胞从培养瓶 倒入离心管内离心后，倒掉清液，还要向培养瓶内加 入细胞分散液(即威尔逊液)，振荡培养瓶使贴壁细胞 全部脱落，再倒入另一离心管离心，去掉威尔逊液，把 两次离心的沉淀细胞混合以这种方法收获培养瓶上 的贴壁细胞，不仅要额外消耗许多化学药品，而且为 了收获贴壁细胞，还须投入较多人力，花费许多时 间。并且威尔逊液对活细胞有破坏作用，随着培养时 间增加将导致死亡细胞数增加，影响疫苗的质量。

本发明就是为了解决培养细胞贴壁问题，使其增 殖细胞都悬浮于培养液中，以简化收获贴壁细胞的产 生过程，从而达到节省人力、时间、药品，减少投资，降 低细胞死亡数的目的。

本发明的特征是在无菌的操作下，把种子细胞接 入培养瓶内的培养液中，将培养瓶于37℃温室下放 置转管机上转动培养，培养瓶以每小时50至60转转 动，培养120小时，繁殖一代，连传十五代以上制苗， 其每代增殖细胞完全混合于悬浮液内，大部分结为集 团细胞，少数单细胞分散于悬浮液中。

本发明解决细胞贴壁问题是通过下列方式实现 的：

为了阻止或破坏细胞贴壁现象的发生，首先肯定 了不能用化学方法长时间脱壁，因化学药品接触活细 胞时间越长，对细胞破坏性越大，造成细胞死亡数增 加，实验证明：活细胞在威尔逊液内70分钟，活细胞 死亡2％，120分钟，活细胞死亡60％，因此，发明人 采取了物理方式，即用改变培养瓶旋转速度方式解决 细胞贴壁问题。基于这种设想，考虑到细胞培养瓶自 身旋转的速度越快，则细胞停留在一个固定位置的时 间越短，则贴附于该处的机会和可能性就越小；当转 速达到某一速度时有可能出现细胞贴壁功能的受阻 或遭到破坏。因此，作了转速与细胞贴壁率之间的关 系试验，实验结果在表1中给出：

表1  转动培养牛焦虫疫苗所用转速与细胞贴壁 率之间的关系

根据旋转速度与细胞贴壁率的关系测定结果表 明：细胞培养瓶的旋转速度达到40周/小时时，细 胞贴壁率降为1％，旋转速度达到50周/小时，以 及速度超过50周/小时以上，细胞贴壁率皆为 0％固将阻止细胞贴壁现象产生最低转速定为 50周/小时。

更有意义的是，在我们分析转动培养的转速与细 胞脱壁率的关系时，还研究了转动培养的转速与细胞 存活率的关系，其测定结果如表2所示

表2转动培养牛焦虫疫苗转速与细胞存活率之 间的关系

根据表2所示结果可以看出，将静止培养改为转 动培养，达到60周/小时转速时并未出现活细胞死 亡现象，但继续增加转速时，细胞存活率开始下降，因 此，把转速60周/小时确定为最适转速的上限值。 观察与分析结果表明，转动培养的细胞在形态构造、 体积、透明性、悬浮生产性能。含裂殖体百分率， pH变化以及疫苗的质量、效力等方面，与静止培养 没有差异。