[其他]L-肉毒碱的微生物学制备方法

说明书

以三甲铵丁烯内酯及／或γ－三甲铵丁内酯为原料，用微生物学方法制造Ｌ－肉毒碱。

人们已知，用γ-三甲铵丁内酯（γ-Buryrobetaine）作原料可以制造L-肉毒碱。有一种工艺方法是，在有2-氧代戊二酸钠（Natrium-2-oxoglutarat）、还原剂、铁离子源及作为羟基供给体的空气氧存在下，使γ-三甲铵丁内酯与由粗糙链孢霉孢子（Sporen von Neurospora crassa）释放出来的羟化酶相接触（美国专利说明书第4371618号）。这种工艺方法的缺点是需要很多辅助因素。于是乎在反应中要使化学计算量的2-氧代戊酸盐（2-oxoglutarat）用氧化法脱去羧基、生成丁二酸盐（Succinat）。作为O₂的活化剂，需用Fe²⁺;为使铁离子保持还原态，需用抗坏血酸;为分解有害的痕迹量H₂O₂，需用过氧化氢酶（Katalasc）。

林特施泰特（Lindstedt）等（Biochemistry 6，1262-1270（1967）“The Formation and Degradation of Carnitine in Pseudomonas）分离出一种以γ-三甲铵丁内酯为碳、氦来源而生长成的假单胞菌属微生物。降解过程的第一步反应是将γ-三甲铵丁内酯经羟基化反应生成L-肉毒碱，并将中间存在的L-肉毒碱进一步完全分解代谢成CO₂、H₂O及NH₃。

即使利用这种由细菌制得的羟化酶（Hydroxyl-ase）来制造L-肉毒碱，也仍存在上述需要辅助因素的缺点（Lindstedt et al，Biochemistry 16，2181-2188（1977）“Purification and Properties of γ-Butyrobetaine Hydroxylase from Pseudomonassp.AK1”）。

本发明所赖以为基础的任务是找出一种新的微生物，这种微生物不具有上述已知工艺方法的缺点，并使人们有可能使用简单的方法以三甲铵丁烯内酯（Crotonobetain）、三甲铵丁内酯或其混合物为原料不制造外消旋盐，而制造有拮抗选择性的L-肉毒碱。

本发明的微生物不同于现有技术中已知系统的是，使用H₂O作为羟基供给体，而不使用O₂作为羟基供给体。这可以使用H¹⁸₂O及O¹⁸₂进行仔细的试验来证实。

本发明所发现的微生物有能力以三甲铵丁烯内酯及/或γ-三甲铵丁内酯为原料来生产L-肉毒碱，而且不会将其分解代谢。

对取自四大州的土壤样品进行了对比试验，正如试验结果所表明的那样，到处都存在将三甲铵丁内酯和三甲铵丁烯内酯经由L-肉毒碱进行分解代谢的微生物。从废水处理设备的加菌淤渣中也可以成功分离出这类微生物。如果将这类微生物按照下面所述的本发明原理进行诱变，则有可能将所有这类菌种用来生产L-肉毒碱。

这种诱变种可以通过下列选择方法而得到：1）将以三甲铵乙内酯（Betain）、γ-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的微生物用常规的方法进行诱变。2）从通过培养得到的已诱变的微生物培养物中选择出那些不分解代谢L-肉毒碱而且不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、γ-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的稳定微生物。

最好在接着的选择步骤2）之后选择出那些分泌L-肉毒碱又不依靠L-肉毒碱、三甲铵丁烯内酯、γ-三甲铵丁内酯而仅依靠三甲铵乙内酯生长的微生物。

相应地将那些已诱变过的微生物在三甲铵乙内酯培养基中继续培养并在进行选择步骤2）之前，将这些已继续培养过的微生物最好在L-肉毒碱培养基中继续培养。培养以三甲铵乙内酯、γ-三甲铵丁内酯、三甲铵丁烯内酯及L-肉毒碱为碳、氮来源生长的菌种相宜地应这样进行，即通过三甲胺铵丁烯内酯营养液接种使混合培养物由细菌混合物产生出来、然后借助传统的微生物学技术再用该混合培养物作原料对那些能降解三甲铵丁烯内酯的微生物进行纯培养。