[发明专利]邻苯二酚胺类分析法

说明书

本发明是使邻苯二酚胺类转化为三羟基吲哚，然后经固相萃取。使其附着在高速液相色谱仪上分离，进行荧光分析。本发明为再现性良好，灵敏度高，价格低廉的邻苯二酚胺类分析法。

过去，血浆、尿等的生物试样中的邻苯二酚胺类的分析法，是把邻苯二酚胺类萃取出来，再洗提，把洗提液附着在用二氧化硅为担体的化学结合型逆相柱子并用酸性缓冲液流动相进行洗提的高速液相色谱仪上分离。随后使三种反应试剂按次序进行反应，转化为三羟基吲哚（THI），进行荧光分析，即所谓柱后法。

上述方法中，为了把用高速液相色谱仪分离的邻苯二酚胺类转化为THI，需要用泵输送3种反应试剂。若用ペリスタリツク泵等价格低的泵时，发生脉动，噪音水平升高。而用无脉冲泵，虽然能降低上述脉动，但价格高，两种情况都不能使噪音水平降低到一定值以下。另一个问题是，由于高速液相色谱仪的洗提液与反应试剂混合而稀释，使分析的灵敏度下降。

本发明的目的是为了改进上述问题而提出的再现性良好，灵敏度高而价格低的邻苯二酚胺类的分析法。

本发明提出了邻苯二酚胺类的分析方法，这个方法的特征是，往含有邻苯二酚胺类试样中或从这个试样中萃取出邻苯二酚胺类的萃取液中，按顺序加入第1反应试剂铁氰化钾缓冲液，第2反应试剂抗坏血酸（维生素C）水溶液或含有乙二胺四醋酸的抗坏血酸水溶液及第3反应试剂氢氧化钠溶液，使邻苯二酚胺转化为三羟基吲哚。其反应液经固相萃取后，使其附在用二氧化硅为担体的化学结合型逆相柱子并用酸性缓冲液流动相进行洗提的高速液相色谱仪上分离，进行荧光分析。

本发明方法的特征是，开始就使邻苯二酚胺转化为THI，然后对THI进行固相萃取，除去其中共存的反应试剂及杂质，待THI变得稳定之后，使其附在高速液相色谱仪柱上分离，然后进行荧光分析。柱前进行这种三羟基吲哚反应的邻苯二酚胺类的分析法，以前没有。

本发明中，可以在含有邻苯二酚胺类的试样中直接加入3种反应试剂，使邻苯二酚胺类转化为THI。也可以用常规方法（例如，用硼酸凝胶、氧化铝萃取后，用酸洗提的方法）使邻苯二酚胺类萃取出来后，加入反应试剂，转化为THI。

如上所述得到的含有THI的反应液中，加入柠檬酸水溶液等酸，使pH降低到3～5之后，再使THI进行固相萃取。如用BondElutC₁₈（ァナリテイケム公司制造）、Sep-packC₁₈（ウオ-タ-ブ公司制造）等，使THI吸附在反相色谱仪的前处理用二氧化硅的柱子上，再用例如柠檬酸钠水溶液与甲醇的混合液，乙腈与甲醇的混合液等洗提。

把所得到的洗提液、附在用二氧化硅为担体的化学结合型反相柱子并用酸性缓冲液的流动相进行洗提的高速液相色谱仪上分离，然后进行荧光分析。柱子使用ゾルバツクスODS（杜邦公司制）、Shim-packFLC-ODS（岛津制作所制）等，流动相是用pH为4～5的柠檬酸钠、醋酸钠、磷酸钠等的水溶液。

根据本发明的柱前法，如上所述THI附在高速液相色谱仪柱上之前，进行固相萃取除去反应试剂及杂质，因而THI在化学上变得稳定，从而得到再现性良好的分析结果。再有，本发明的方法，与过去所使用的柱后法比较，没有因稀释而引起的荧光分析光谱的峰形宽大的问题，分析的灵敏度高。并且不需要各种反应试剂输送用的泵及反应管。因此具有价格低的优点。

实施例

人血浆试样1ml按常规方法用氧化铝处理，取含有邻苯二酚胺的萃取液200μl，按下列顺序使邻苯二酚胺转化为THI，进行固相萃取。

（1）加入第1反应试剂

含有1w/v%铁氰化钾的0.1M磷酸钾缓冲液（pH6.8），加入30μl，放置30秒。

（2）加入第2反应试剂

1w/v%抗坏血酸水溶液，加入50μl，放置30秒。

（3）加入第3反应试剂

10N的氢氧化钠溶液，加入50μl，放置10分钟。