[发明专利]生物表面活性剂的制备方法

说明书

本发明是一种生物工程。

用微生物来生产表面活性剂是七十年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。微生物在代谢过程中常分泌一些生化产物，其分子结构具有亲水和疏水两种组分，如糖脂类、磷脂类及脂蛋白类等，生物表面活性剂具有乳化、破乳、润湿、增溶、发泡、消泡、抗静电、抗腐蚀等功能，因此应用范围甚广，可应用于石油三次开采，消除石油污染及日化、食品和纺织工业等方面。

根据现在研究情况来看，糖脂是最主要的一类生物表面活性剂，日本花王石碱株式会社用球拟酵母（TorulopsisSF）生产槐糖脂（特许公报：昭57-92785，92786），日本S.ltoh实验室用假单孢菌（Pseudomonassup）生产鼠李糖脂（J.Antibiotics23，855，1971）西德Wagner实验室用红球菌（Rhodococcuserythropolis）生产海藻糖单脂及海藻糖二脂（GerPatDE-2646505，DE-2646506，DE-2646507），其中海藻糖脂有良好的表面活性性能，可用于石油三次开采等方面，DE-3248167报导以节杆菌生长细胞生产海藻糖脂类化合物的方法，但是该法不仅培养其成份复杂、方法繁琐，而且周期长、产率低、成本高。但上述专利中糖脂的产量仅5-10克/升。

为了使糖脂达到工业化生产水平，必须改进培养方法，提高产量，降低成本。

本发明是一种微生物生产海藻糖脂类表面活性剂的方法，具体地说是一种用简单节杆菌（Arthrobactersimplex）生产海藻糖单脂和海藻糖四脂的方法，该方法包括用节杆菌在最佳培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物或者用节杆菌休止细胞，制备海藻糖脂类化合物。

用本发明的节杆菌在培养条件下，进行代谢调节制备海藻糖脂类化合物的方法，即在节杆菌存在下的培养物中加入酸或碱，调pH至4-8，以0.5-1.5（体积比）/分钟的空气或富含氧气的空气通入培养物，培养温度为20°-40℃，最佳为25°-30℃。在培养液中含有铵盐或硝酸盐作为氮源以及其它为繁殖细胞所必需的无机盐类和生长因子、正烷烃、馏份油、原油、植物油和糖类可作为碳源，发酵终了，发酵液用1-3.5倍量的氮仿或二氯甲烷∶甲醇为＊1.5-3∶1（V/V）的溶剂或者用乙酸乙酯提取。

在上述方法中，本发明用节杆菌产糖脂的最佳培养条件是，可用玉米浆、旦白胨、牛肉汁、酵母膏作有机营养源，但用酵母膏最好，酵母膏用量控制在0.1-0.5%。另外该菌对微量元素也有特殊要求Zn⁺⁺、Mn⁺⁺、Ca⁺⁺元素要控制一定量，培养液中含有ZnSO₄·7H₂O为0.001-0.005克/升，MnSO₄·2H₂O为0.01-0.05克/升。CaCl₂·2H₂O为0.01-0.05克/升。使菌体中蛋白质合成控制在一定数量，体内主要进行脂肪代谢，培养液中要控制一定比例的碳、氮源，氮源不能太高，控制碳源和氮源比例为30-40∶1发酵过程中维持pH4-8，不用氨水，而用KOH或NaOH来调节。

用本发明的节杆菌休止细胞，生产表面活性剂的方法，首先将节杆菌培养休止细胞，再用休止细胞直接生产海藻糖脂类化合物：先找出利用何种廉价碳源能生产菌体，节杆菌能长于葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、废糖蜜、甘油、醋酸盐等碳源，其中废糖蜜和葡萄糖是较合适的碳源，菌体产量能达10克/升，将休止细胞悬浮于碳酸缓冲液、生理盐水、蒸馏水或自来水都能产生糖脂，而以磷酸缓冲液作培养液产糖脂最多，磷酸缓冲液浓度可为0.1-0.5M，pH为4-7培养温度为20°-40℃，最佳温度是25°-30℃，节杆菌休止细胞产糖脂可用各种糖类、正烷烃、馏份油或植物油作碳源，其中正烷烃转化率能达0.4-0.6。

利用本发明的方法，节杆菌休止细胞在地下适当条件下，如温度15°-40℃，通空气，pH控制在4-8，可直接用于石油的三次开采，采用本发明的方法，用节杆菌生产出的糖脂类化合物是海藻糖四脂和海藻糖单脂，二种糖脂间的比例也是随着代谢调节改变的，当氮源非限制培养时，产物主要是海藻糖单脂，而当氮源限制时，产物则主要就是海藻糖脂，用休止细胞培养时产物极大部分是海藻糖四脂。用本发明的方法生产所得的海藻糖脂可用石油三次开采及日化、纺织、食品等工业。

海藻糖四脂：

海藻糖单脂：