[其他]促血红细胞生成素的生产

说明书

本发明关系到遗传物质的操作，更具体地是介绍一种使人们有可能把天然形成的促血红细胞生成素多肽的部分或全部一级结构和/或这种多肽的一种或多种生物活性人工地进行生产的DNA重组操作步骤。

A遗传物质的操作

遗传物质可以广义地定义为这样一类化学物质、即它们可以编码细胞和病毒的组分，并且支配这些组分的制造过程，而且还可以指导细胞和病毒的应答。一种称作脱氧核糖核酸（DNA）的长链聚合物质，是除去某些由核糖核酸（RNA）所编码的病毒以外的包括所有的活细胞和病毒的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，每一个核苷酸单位都是嘌呤（腺嘌呤或乌嘌呤）或嘧啶（胸腺嘧啶或胞嘧啶）连到带有一个磷酸基团的脱氧核糖上边。核苷酸以线性方式聚合：一个核苷酸的5′磷酸与另一个核苷酸的3′羟基结合而相互衔接。功能性DNA是以单链核苷酸（称作寡聚脱氧核苷酸）结合成稳定的双链形式而存在的，这种结合是因为有嘌呤与嘧啶碱基之间的氢键而存在的（即在腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）之间或乌嘌呤（G）与胞嘧啶（C）之间存在的互补配对。按常规而言，核苷酸是以其嘌呤或嘧啶碱基成分的名称而称呼的，双链DNA中的核苷酸互补配对（即A-T和G-C）则被称为“碱基对”。核糖核酸是一个由腺嘌呤，乌嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶（U）（不含有胸腺嘧啶）与核糖及一个磷酸基相连接的多聚核苷酸。

概括地讲，DNA的编码功能是通过一个过程而起作用的，在该过程中，特殊的DNA核苷酸序列（基因）被“转录”到相应的不稳定的信使RNA（mRNA）中。然后，mRNA作为由各种氨基酸形成结构蛋白、调节蛋白及催化蛋的模板。在这个mRNA“翻译”过程中还有小的RNA链（tRNA）参加，tRNA转运氨基酸，并使一个个的氨基酸沿着mRNA链-排列在一起形成具有正确氨基酸序列的多肽。由DNA衍生出来的mRNA“信息”以三联体“codon”密码子的形式存在，三联体是指有一定顺序的三核苷酸小组密码子指出需要什么样的tRNA以及为了“表达”一生成特定的多肽-应当搬运20种氨基酸中的哪一种氨基酸。换言之，蛋白质的形成是基因的核苷酸序列所编码的遗传信息的最终“表达”形式。

DNA“启动子”序列通常是处在DNA聚合物中的一个基因的“前边”并为mRNA的起始转录提供一个特殊的位点。DNA“调节”序列通常也是在给定的DNA聚合物的一个基因的“上边”（即前边），那些决定转录起始速度的蛋白质。结合到“调节”序列上。这个调节序列由合起来叫做“启动子/调节子”的部分，它处在一个功能性DNA聚合物中，通常也位于一个（或一系列）被选择的基因之前。这个部分的DNA序协同地决定着这一个（或这一系列的）基因的转录（及最终的表达）是否会发生。在DNA聚合物中的一个基因“后边”则还有一个对转录成mRNA的起到终止信号的DNA序列，它被称为转录“终止子”序列。

在过去十年里，微生物学进程的一个焦点是试图用生物体进行工业性制造药理上有显著作用的物质，这些生物既不是开始就在它们的DNA中具有关于所需产物的遗传密码信息，（在培养中的哺乳类细胞这种情况下，或者也不是原来就能在合适的水平上表达染色体基因）简言之，一个特定着所需多肽产物结构的基因，要么是从“供体”生物中分离出来的，要么就是化学合成的，并且后来稳定地诱导到另一个生物中，该生物是较好地能自我复制的单细胞生物，如细菌，酵母或组织培养的哺乳类细胞。当完成这一步后，存在于“转化的“或““转染的”微生物宿主细胞中的基因表达的这个新的机器部分，就进行操作制造出所需的产物：用外源DNA作为模板转录新的mRNA，接着，该mRNA再转化成氨基酸残基的连续序列。

有关“目的”遗传物质的分离、合成、提纯、放大及将其引入转化到选用的宿主细胞中的这一整套操作，被称为“重组DNA”方法。有关这一技术的专利及文献是很丰富的。例如Cohen等人的美国专利4237244，涉及到病毒DNA或环状质粒DNA杂交体对单细胞宿主生物的转化，这些杂交体DNA包含有所选择的的外源性DNA序列。Cohen等人的专利中的过程，首先介绍了用酶学方法切开病毒的或环状的质粒DNA以形成线状DNA链从而选出转化载体的操作。选择的外来（“外源的”或“异源的”）DNA链通常包括编码所需产物的序列，它们是用相似的酶经切割后制成线形的DNA片断。在有连接酶存在的条件下，切成线状的病毒或质粒DNA载体，与外来DNA片段一起进行温育，该连接酶能进行一个复原过程从而形成“杂交”hybrid载体：被选择的外源DNA片断“拼接”到病毒的或环状的DNA质粒中，于是形成了杂交载体。