[发明专利]泯活素的制备方法及其应用

说明书

本发明是基于发现了在人血单核细胞的粘附单层培养的上清液中含有泯活素（原译“茗萘酊”），这是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的有效钝化剂。已证明泯活素是这种血纤维蛋白溶酶源活化剂的天然钝化剂，而这种血纤维蛋白溶酶原活化剂与侵入性的肿瘤有关，因此，泯活素是体内防御肿瘤的入侵和转移的关键因素。另外，泯活素还有其他潜在的用途，可在人类的医药范围内作为临床药剂，亦可用于各类癌症的体内外诊断和治疗。泯活素亦已从巨噬细胞和源自单核细胞的转化细胞的培养中分离和鉴定出来。

本发明的第一部分是提供一种基本纯化的产品，泯活素，它是尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性钝化剂。本发明还提供一种含泯活素（尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的特异性钝化剂）的培养上清液，该上清液是由产生泯活素的细胞体外培养得来的。本发明还进一步提供一种由含泯活素的培养上清液得来的产品，在此培养上清液中泯活素至少已部分纯化。泯活素另外的特点将于下详述。

本发明的另一部分是，提供泯活素的生产方法，包括体外培养生成泯活素的细胞及回收培养上清液，从该上清液中可回收得到至少部分纯化的泯活素。经培养可产生泯活素的细胞包括人血的单核细胞、某些巨噬细胞和转化的人细胞系，下面将详尽地介绍这些细胞。含有这些细胞所分泌出来的泯活素的培养上清液经过处理以浓缩泯活素，然后进一步处理以除去上清液中其他组分，从而获得至少部分纯化的泯活素。这种浓缩和纯化可以靠，例如，苯基-琼脂糖疏水作用层析或二乙胺基乙基-琼脂糖离子交换层析来达到，然后把所需的产物洗脱。这产物可在Cibacron蓝色琼脂糖或羟基磷灰石上进行亲和层析，以便从含有泯活素的产物中除去更多的杂质。

试验证实泯活素是一种蛋白质，其特征是表观分子量约为60-70000（用凝胶过滤层析来测定），而它的抑制作用对Mr52，000（HPA52）和36，000（HPA36）的血纤维蛋白溶酶原活化剂（如尿激酶）具有特异性，表现在：1）抑制依赖于血纤维蛋白溶酶原的纤维蛋白溶解，ⅱ）在比色测定中在血纤维蛋白溶酶原活化的水平上起抑制作用，和ⅲ）在培养介质中预温育后，会不可逆地丧失激活血纤维蛋白溶酶原的活性（可用电泳现象来证明）。由泯活素和HPA36型血纤维蛋白溶酶原活化剂所形成的复合物对洗涤剂具有抗性，其M_r在70-75，000的范围内（泯活素-HPA36复合物）。

已进一步证明泯活素优先抑制尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂，而不是胰蛋白酶、血纤维蛋白酶或“组织型”的血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA66，或M_r66，000的活化剂）。

泯活素不只由人单核细胞产生，还可由某些巨噬细胞和巨噬细胞系的转化细胞产生。特别是粘附单层培养的腹腔和骨髓巨噬细胞，可产生和分泌出相当大量的泯活素。在培养液中有地塞米松存在的条件下，人巨噬细胞系U937亦可产生泯活素。在本发明在这方面的进一步发展中，粘附单层培养的血单核细胞产生泯活素可被胞壁酰二肽（佐剂肽）、细菌脂多糖或含淋巴因子的活化人淋巴细胞培养上清液所刺激或增强。

当人结肠癌细胞系COLO    394的培养中加入泯活素时，它特异性地抑制血纤维蛋白溶酶原活化剂（HPA52），从比色测定的电泳可证明之。另外，泯活素亦可特异地抑制外科切除的人肿瘤组织匀浆中血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性。已经证明在结肠肿瘤组织中比正常组织中的血纤维蛋白溶酶原活化剂水平高出相当多。其他的研究者从很多的实体瘤中亦记录到相似的观测结果。

因此，由于泯活素对尿激酶型血纤维蛋白溶酶原活化剂的专一性和在肿瘤组织内明显升高的血纤维蛋白溶酶原活化剂水平，这种产物可用于肿瘤造影，特别是那些产生血纤维蛋白溶酶原活化剂的实体瘤如乳房、前列腺、结肠和肺的肿瘤可用泯活素来确定。虽然这类癌症通常可以用外科手术切除，但用泯活素作肿瘤造影特别有利于检出外科切除后的小转移病灶。由于泯活素是一种天然的产物，它的优点是没有抗原性，可避免体内的排斥问题。在体内对这些肿瘤造影时，可用标记的泯活素（例如用适宜的放射性同位素，如锝⁹⁹），当施用后，用泯活素所描绘的肿瘤的位置和界限可用熟知的放射性同位素方法测定。