[其他]能表达脱辅基水母发光蛋白(Apoaeq-uorin)的重组DNA载体

说明书

蛋白（Apoaequorin）的重组DNA载体

本发明涉及遗传工程领域，特别是把脱辅基水母发光蛋白基因插入到重组DNA载体中以在受体微生物菌株中生产脱辅基水母发光蛋白的技术。本申请是1984年12月31日美国专利申请号687903一案的部分继续申请。

脱辅基水母发光蛋白是一种单肽链蛋白质，它可以从发光水母（Aequorea    Victoria）中分离得到。该蛋白含一个与其非共价结合的腔肠动物荧光素分子，结合后称其为水母发光蛋白（aequorin）。在有钙离子存在时，水母发光蛋白被氧化，并发出可见光。发光后即可把水母发光蛋白的蛋白部分与荧光素分离并纯化出来，然后又可用天然或合成的荧光素与该蛋白部分重新装配。把钙离子加到重新形成的水母发光蛋白将再次导致发光。因而，这种脱辅基水母发光蛋白可在许多化学和生化试验中被用作标记物。

天然的脱辅基水母发光蛋白不是单一化合物而是几种分子大小不同物质的混合物。把上千个水母（Aequorea）得到的纯天然水母发光蛋白在所用各种缓冲液均含有0.1mM    EDTA的非变性条件下，在碱性缓冲液中电泳，然后将电泳后凝胶（0.5cm×10cm）浸在0.1M    Ca    Cl中，发现至少有6个可见的兰色荧光带。这个观查结果与J.R步布林克（J.R.Blinks）和G.C.哈瑞（G.C.Harres）得到的结果一致（刊载在Fed·Proc.1975年34期474页）。他们在把同样萃取物用等电聚焦电泳分离时观察到12条荧光带。Blinks和Harres之所以观查到更多种不同大小分子的电泳带是由于等电聚焦电泳比普通电泳有更高的分辨率。但得到的任何一个带都不是一种纯的肽。

然而，很难从水母或其它天然原料中生产足够量的水母发光蛋白或脱辅基水母发光蛋白以满足生物荧光试验的所需量。因此，急需生产足够量的商业用脱辅基水母发光蛋白的一种改进方法。

最近发展的技术使人们可以利用迅速而大量生产的微生物合成商业上有用的蛋白和肽，不管它们的天然来源如何，这些技术使人们可以使用遗传学上合适的微生物合成正常情况下在其它机体中创造的蛋白质和肽。该技术是应用一切生物中存在的遗传物质DNA和其合成的蛋白质的关系，也就是说蛋白质中氨基酸顺序反映了DNA的核苷酸的顺序。蛋白质有常见的二十种氨基酸，每种氨基酸都特异地与一种与多种三核苷酸顺序相关联。这种关系构成了遗传密码。所有生物的遗传密码都是相同或相似的。由于很好地了解到这种关系，核苷酸顺序反映着每种蛋白或肽的氨基酸顺序。因而，原则上说任何生物都可把相同核苷酸顺序翻译成相同氨基酸顺序。

表1

遗传密码

苯丙氨酸（Phe）TTK    组氨酸（His）CAK

亮氨酸（Leu）XTY    谷氨酰胺（Gln）CAT

异亮氨酸（Ile）ATM    谷氨酰胺（Asn）AAK

蛋氨酸（Met）ATG    赖氨酸（Lys）AAJ

缬氨酸（Val）GTL    天冬氨酸（Asp）GAK

丝氨酸（Ser）QRS    各氨酸（Glu）GAJ

脯氨酸（Pro）CCL    半胱氨酸（Cys）TGK

苏氨酸（Thr）ACL    色氨酸（Try）TGG

丙氨酸（Ala）GCL    精氨酸（Arg）WGZ

酪氨酸（Tyr）TAK    甘氨酸（Gly）GGL

终止信号    TAJ

终止信号    TGA

注：每个三联字母表示DNA从左端5′到右端3′的三个核苷酸。字母代表组成核苷酸顺序的嘌呤和嘧啶碱。

A＝腺嘌呤    G＝鸟嘌呤    C＝胞嘧啶

J＝腺嘌呤或鸟嘌呤    K＝胸腺嘧啶或胞嘧啶    L＝腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤    M＝腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶    T＝胸腺嘧啶X表示如果Y是腺嘌呤或鸟嘌呤，

则X就是胸腺嘧啶或胞嘧啶

如果Y是胞嘧啶或胸腺嘧啶

则X就是胞嘧啶

Y表示如果X是胞嘧啶，则Y就是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。

如果X是胸腺嘧啶，则Y是腺嘌呤或鸟嘌呤。

W表示如果Z是胸腺嘧啶和胞嘧啶，则W是胞嘧啶或腺嘌呤;

如果Z是胞嘧啶或胸腺嘧啶，则W是胞嘧啶。

Z表示如果W是鸟嘌呤，则Z是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶;

如果W是腺嘌呤，则Z是腺嘌呤或鸟嘌呤。

QR表示如果S是腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶或胸腺嘧啶则QR是胸腺嘧啶-胞嘧啶;