[其他]制造犬细小病毒疫苗的方法

说明书

本发明涉及一种新的犬细小病毒疫苗，一种制备该疫苗的方法，一种新的犬细小病毒株，以及一种使犬免受犬细小病毒感染的方法。

犬特别是年青犬受到犬细小病毒（CPV）的感染，常常导致以急性腹泻、发热、白细胞减少（相对地淋巴细胞减少）为特征的肠道疾病。

虽曾研究出一种防止犬受CPV感染的痰苗。然而，当存在母体获得性抗体（MDA）时给予这些疫苗常常是无效的。对某些幼犬，这种被动免疫可能以足以妨碍疫苗接种的水平，持续相当长的时间（四个月或更长）。其后，随着MDA水平的降低，狗可能不足以对抗感染和疾病的侵袭，而仍难于接种成功。因此，在这些幼犬的生命早期的相当长时期内，仍不能得以保护;特别是在由母体获得的免疫性消失之后，整个一窝仔犬受感染的危险就显现出来了。

为此，很需要有一种对幼犬生命早期能够进行成功免疫的CPV疫苗。

本发明的目的即是制备这样一种疫苗的方法。

依据本发明而制得的疫苗，其特征在于它包含得自一种CPV病毒株（内部编号为154）的病毒。这种病毒株的样品已寄存在法国巴黎巴士德研究院的国家微生物培养物保藏中心（Colleetion    Nationale    de    Cultures    de    Mieroorganisms），寄存号为1-404。

依据本发明的疫苗，最好含有活的减毒CPV病毒株。

减毒是通过在细胞的培养物中经一系列传代完成的，所用的细胞取自犬或猫科动物，传代于大约37℃下进行。每一步都是由上次培养步骤的培养物中收取病毒，之后接种到含有新鲜细胞培养物的培养基中。培养所使用的细胞是按本领域内已知的方法制备的。

为制备该疫苗，可将减毒的种株病毒培养在一细胞培养物中，如一种猫科动物的胚胎纤维母细胞（FEF）培养物。所用的培养温度最好是犬的正常体温。收集组织细胞培养液和/或细胞，以收获经培养的病毒。为了提高病毒收获率，可以使用某种提高由培养基质中释放出的传染颗粒的技术，如用超声处理。可将疫苗制成悬浮液形成或冻干品。对于冻干的CPV疫苗，最好向其中加入一种或多种稳定剂。适用的稳定剂如SPGA（详见Bovarnick（1950）：J.Bacteriology    59，509）醣类（如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖、葡萄糖）、蛋白质（如白蛋白或酪蛋白），或是其降解产物、含蛋白制剂（如小牛血清或脱脂奶）以及缓冲液（如碱金属磷酸盐）。必要时亦可加入一种或多种具有佐剂作用的化合物。适用的佐剂如氢氧化铝、磷酸盐或氧化物、矿物油（如BayolF，Marcol    52）以及皂角苷。

另外，依据本发明的疫苗亦可含有灭活的CPV病毒株。

依据本发明灭活的CPV疫苗，是由经处理失去了复制能力和毒力的病毒制得的。一般地，这可以通过化学或物理的方法达到。化学灭活，如可以用酶，甲醛、β-丙内酯或吖丙啶或其衍生物、某种有机溶剂（如卤化烃）和/或去污剂（如吐温、Triton    X、脱氧胆酸钠、磺基三甲铵乙内酯或十六烷基三甲基铵盐）处理病毒来完成。物理灭活，可通过用高能射线对病毒进行照射来完成，如可使用紫外光，r射线或x射线。必要时，处理后可将灭活剂中和掉，例如可用硫代硫酸盐来中和甲醛灭活制剂。如有必要，继后亦可将PH值调回大约PH7。一般地，可向灭活病毒制品中加入某种佐剂，并且可加入一种或几种乳化剂（如吐温和斯潘（TWeen和Span））。

依据下列特征，将该病毒株154鉴定为犬细小病毒：

（ⅰ）在猫科或犬科动物细胞内有繁殖能力。

（ⅱ）不能在没有分裂能力的猫科和犬科动物细胞中繁殖。

（ⅲ）细胞培养物中所产生的血凝素在PH7.2时可使猪红细胞凝集，但不能使人类或啮齿动物的红细胞凝集。

（ⅳ）在细胞培养物中产生典型的核内含体。

（ⅴ）它可被制备的猫和兔的抗猫传染性粒细胞缺乏症（猫瘟）病毒和已知的犬细小病毒抗血清所中和。

（ⅵ）血凝作用可被抗猫传染性粒细胞缺乏症（猫瘟）病毒和已知的犬细小病毒抗血清所抑制。

此外，根据下列特性可将该新的CPV病毒株同迄今已知的CPV病毒株进一步区分开：

a.它能够于37℃，在猫和犬的纤维母细胞样细胞中生长繁殖良好，并表现出特征性的细胞病理效力。将依据本发明的病毒株与已知的CPV病毒株相比较，总结出其生长特征，如下面表1所示：

表Ⅰ

不同的CPV病毒株在不同的细胞培养系统中生长繁殖的能力

所使用的

细胞培养物    A72    FEF    CRFK