[其他]龋齿预防制剂和制备该制剂的方法

说明书

本发明一般地涉及用于确保外源基因产物的微生物表达的重组方法和材料。特别是涉及用于预防龋齿的微生物制剂和其生产方法。

Streptococcus    mutans通过由蔗糖合成细胞外多糖聚合物粘附于牙釉质的表面，而引起龋齿。这些多糖中最重要的就是葡聚糖。第一种类型的葡聚糖主要含有α-1，6键（见图1），类似于经典的右旋糖酐（dertrans）。第二种类型的葡聚糖则主要含有α-1，3键，且不易溶于水。S.mutans和其它生龋微生物粘附于牙齿表面并分泌有机酸和其它物质而引起牙齿腐蚀，其分泌的有机酸和其它物质可引起牙齿结构之无机成分的脱矿质作用，以及残存有机基质的溶解作用。

过去是用牙刷刷牙和使用牙用涂腊绪丝，机械地除去牙齿噬斑（噬斑为一种生龋细菌、不溶性葡聚糖和其它材料的复合物）。然而，重要的是在牙齿被强力刷净之后，细菌又迅速地在几分钟内吸附于牙釉质表面，之后在一、两天内又出现放大镜下可见的菌落。另外，因为噬斑常完整地保留在牙刷或牙用涂腊绪丝难于达到的部位，故很难确保彻底地清洁牙齿。

最近出现了一系列通过酶分解不溶性葡聚糖聚合物的α-1，3和α-1，6糖苷键的牙膏。这类牙膏的特点是含有α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶（α-1，6葡聚糖酶或右旋糖酐酶）或α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶（α-1，3葡聚糖酶）。在美国专利4，486，330号中，Yoshida等人公开了用于人假牙的清洁组合物，是含有溶于适当缓冲液的β-1，3葡聚糖酶。Simonson等人在美国4，328，313号专利中，Guggenheim等人在美国4，353，891号专利中，公别公开了用于噬斑扩散的α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的生产方法。在美国4，438，093号专利中，Shimada等人则公开了一种用于预防和抑制口腔疾病的口服组合物，由存在于药用载体上的α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶组成。应用含有裂解这种不溶性葡聚糖的酶的牙膏，在刷牙之后不能期望具有分解牙齿噬斑的明显作用，这是因为牙膏的酶成分在刷牙后例行的冲洗时趋于流失。

迄今尚没有使用重组方法克隆和分离α-1，3或α-1，6葡聚糖酶基因的报导。

根据上面对现有技术的描述，显然需要有一种技术来改进在人类口腔中提供葡聚糖酶活性的方法和材料。这样的方法和材料最好应能长时期恒定地提供葡聚糖酶活性，并最好不需要频繁地使用即可达到目的。

本发明提供不同基因组的DNA组成的重组DNA分子，此重组DNA是在活细胞外末端连接起来的，且具有转化宿主细胞并继续存在于宿主细胞和其后代中的能力。此重组DNA含有选自一组编码α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA序列，并含有为表达编码α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的前导DNA片段杂交的DNA片段。本发明还提供表达α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA分子来转化的宿主细胞。特别举例说明的是大肠杆菌和链球菌宿主。本发明也提供含有编码α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶的基因的重组DNA分子。

本发明进一步提供在口腔内引入和长期维持葡聚糖酶活性的方法和材料。明确地说，本发明包括（1）克隆一种产生α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其两者的细菌的基因，（2）用此等基因转化一种口腔固有的细菌，以使其表达和分泌该基因产物，以及（3）将转化了的细菌引入口腔内。引入口腔内的转化之生物体的浓度，应能持续地在口腔中表达和分泌足够水平的α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其两者，以便降解牙齿噬斑的葡聚糖并防止这种噬斑的聚集，同时防止生龋细菌粘附于牙齿上。对于降解构成牙齿噬斑的不溶性葡聚糖物质来说，结合使用α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶，可产生协同作用。因此，可分别或同时将用于表达和分泌这两种类型葡聚糖酶的基因，引入口腔所固有的一种或不同种转化菌内，并施用于本发明的方法。

下列对本发明的优选实施方案的详细描述，将使本发明的其它方面变得更为清楚。

图1显示不溶性葡聚糖的结构;

图2是存在于大肠杆菌胞浆中的PYEJ001质粒的基因图;

图3是存在于Streptococcus Sanguis胞浆中的_pGB301质粒的基因图;

图4是制备穿梭载体_pMN1的图解说明，该载体是经分别用HaeⅢ和SmaⅠ切断S.Sanguis的质粒_pGB301（9，8Kb）和大肠杆菌的质粒_pUc 9（2.8Kb），并用T₄连接酶将它们连接在一起而制得的;