[发明专利]利用DNA重组技术生产抑制素的方法

说明书

本发明特别涉及到克隆载体的建立，这些载体中含有编码完整或部分称为抑制素的激素的脱氧核糖核酸（DNA）序列，特别涉及到含有这些载体的宿主细胞如菌株的建立，还特别涉及到能产生完整、部分抑制素或其前体的宿主细胞如菌株的建立。此外，本发明涉及到所述载体和菌株的表达产物的产生和利用，还涉及到表达产物和载体的片段的产生和利用，不管它们在本质上是天然的还是合成的。

1932年有人提出，性腺产生一种称为抑制素的非类固醇因子，它与垂体功能的反馈调节有关（McCullagh，D.R.（1932）Science（科学）76卷19～20页）。自此以来，已经证实前垂体至少产生两种促性腺激素，促卵泡素（FSH）或叫follitropin及促黄体生成素（LH）或叫Lutropin，它们共同调节性腺的发育及功能。利用灵敏度很高的放射免疫检测技术，人们能对每种激素进行独立的精确监测，并已证实了这些性腺激素的反馈调节作用。LH的反馈调节似乎主要是通过类固醇物质进行的，而FSH的反馈调节除了类固醇以外，还通过称为抑制素的蛋白质或糖蛋白因子进行。

现在，我们可以将抑制素定义为蛋白或糖蛋白激素，它由卵巢的粒膜细胞或睾丸的谢尔托立氏细胞分泌。它是作为对于FSH的反应而分泌的，它以FSH的合成及分泌的反馈抑制剂作用于垂体，但基本上不影响LH的基础合成及分泌。抑制素的mRNA或前体是否在其它细胞和组织中形成，人们目前还不了解。

七十年代初期以来，人们已作出了一些努力，希望从多种动物的性腺中纯化抑制素，包括睾丸和卵巢，但所获结果并不一致（de    Jong.F.H.（1979）Mol.Cell.Endocrinol.13卷1～10页），这部分是由于他们所用的生物测试系统不同，在这些系统中，对于离体或活体垂体细胞中FSH的任何抑制，可能是由于在测试所测物质的非专一毒性效应时，没有保证同时做抑制素和对照的试验（Baker，H.W.G.等人（1981），见于Franchimont，p.和Channing，C.P.编辑的《生殖的内性腺调节》第193～228页，伦敦科学出版社出版;Baker，H.W.G.等（1982）Ann.New    York    Acad.Sci.383卷329～342页）。

最近，已经从牛卵泡液（bFF）中纯化得到了均质的抑制素（国际专利申请PCT/AU85/00119;Robertson，D.M.等（1985），Biochem.Biophys.Res.Commun.（生物化学及生物物理研究通讯）126卷220～226页）。这是借助于利用严格培养的鼠垂体细胞测试法（Scott，R.S.等（1980），Endocrinol.（内分泌学）107卷1536～1542页）而完成的，此法包括一种测试所测物质的细胞毒性效应的手段（Robertson，D.M.等（1982），Mol.Cell.Endocrinol.26卷119～127页），因此，减少所测细胞FSH含量的非专一毒性效应则能从抑制素效应中单独辨别出来。所用的标准是牛卵泡液制备物，它具有20单位/毫升的抑制素活性，此单位基于前人所述的绵羊睾丸淋巴标准，即主观定义活性标准为1单位/毫克（Scott，R.S.等（1980），Endocrinol.107卷1536～1542页）。

来自bFF的抑制素被纯化大约3，500倍，直至比活达到200，000单位/毫克蛋白，它是一个58KD的蛋白，由两个具有链间双硫键的亚基组成，即亚基A和亚基B，通过有十二烷基磺酸钠存在的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证明，它们分别为大约43KD和15KD。每个亚基NH₂一端的氨基酸序列已经测定。此纯化物质在体外具有原来为抑制素定义的那些生理性质，即抑制鼠垂体细胞内源FSH的合成及释放，而不影响LH如催乳激素和甲状腺激素的合成及释放。

在决定雌性的排卵方式及速率和雄性的精子生成中，FSH起着重要的作用，因此，抑制素、其结构类似物或同源物或抗抑制素抗体的有开发潜力的重要应用，将是抑制或促进人类或家养动物的性腺功能，并作为性腺功能分析的诊断工具使用。利用粗提物或初步分离的性腺提取物或分泌物已经完成了许多活体实验，以期分析抑制素的生理效应。在这些实验中，产生于抑制素或抗抑制素抗体的效应包括如下-

1.抑制性腺功能（Moudgal，N.R.等（1985），见于Sairam，M.R.及Atkinson，L.E.所编《性腺蛋白和多肽及其生物学意义》第21～37页，新加坡，世界科学出版公司出版）。