[其他]水溶性呫吨衍生物底物的制备方法及其应用

说明书

本发明是关于水溶性呫吨鎓衍生物底物，其合成方法以及这类合成底物在测定单独或以彼此结合形式存在的蛋白酶、抑制剂、辅助因子、活化剂和阻活剂之活性方面的应用。

如Leytus等人所报导的〔详见Biochem.Journal    209：299-307（1983）和Biochem.Journal215：253-260（1983）〕，此前已将合成的若丹明110（rhodamine    110）衍生物底物用于荧光测定蛋白酶活性。Leytus等人的这种底物与先前报导的底物相比较，对于测定酶活性具有极好的敏感性。然而也发现，Leytus等人的若丹明110衍生物底物的水溶性很差，即37℃时溶解度约为120微摩尔，因此必须添加有机溶剂添加剂如二甲基甲酰胺和乙醇，以促进底物溶解。但已了解到，作酶分析时加有机溶剂会干扰分析程序，即会使蛋白变性，降低反应速率以及（或者）引起其它反应物或产物的沉淀，以致不能达到最佳试验效果。

除Leytus等人所公开的底物外，Smith等人（见美国专利4，294，923）公开了一种用于荧光或分光光度法测定生物体液中蛋白水解酶的香豆素衍生物底物。Gargiulo等人（见美国专利4，275，153和4，336，186）公开了用于测定生物学样品中蛋白酶活性的发生荧光的aminoisophalate底物。

本发明涉及用于荧光和分光光度法测定蛋白酶活性的水溶性呫吨鎓衍生物底物-下文称之为若丹明110和若道尔（rhodoe）;因其在工作浓度有较好的水溶性，故不必使用如二甲基甲酰胺和乙醇等有机增溶剂，也就不存在它们在试验过程中产生的干扰作用。此外，水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物用于测定蛋白酶活性水平时，较之先有技术中的若丹明110衍生物底物表现有更大的敏感性。鉴于这种增加了的敏感性，所以水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物可用于分光光度试验方法;而先有技术的低水溶性若丹明110衍生物底物在用较小体积的样品和底物进行分光光度和萤光法测定时，不能表现足够的敏感度。本发明的水溶性呫吨鎓衍生物底物可用于测定单独或以彼此结合形式存在的蛋白酶、辅助因子、活化剂和阻活剂的活性，特别是用于测定胰蛋白酶样酶的活性。

本发明的一个目的是提供一种带有可被酶水解之侧链的水溶性呫吨鎓衍生物底物的复合物，这样，侧链的水解是与酶活性成正比的。

本发明的另一个目的是提供具有较好水溶性的呫吨鎓衍生物底物。

本发明再一个目的是消除在测定蛋白酶、辅助因子、抑制剂、活化剂和阻活剂，特别是凝血酶形成的分析方法中使用有机溶剂的需要。

本发明还有一个目的，即提供呫吨鎓衍生物，该衍生物用于分光光度及萤光法测定时有足够的敏感性。

本文所述的合成底物及其水解产物在工作浓度下是水溶性的，因此可在不使用有机溶剂添加剂和（或）特殊的水增溶剂的情况下，用于分光光度和萤光测定。这种新的水溶性底物具有下列结构通式，也包括它们的水溶性盐。

其中：

R₁是增加水溶性的基团，选自肌氨酰基、焦谷氨酰基和戊二酰基;

R₂是呫吨鎓，3′，6′-二氨基-9′-（2-羧苯基）;R₃是呫吨鎓，3′-氨基-6′-羟基-9′-（2-羧苯基）。

若丹明110和若道尔的化学结构式如下：

若丹明110                                                                若道尔

由于蛋白酶对这些化合物的敏感度增加，使得能够检测以前已知方法所不易测到的低水平的酶、抑制剂、辅助因子、活化剂和阻活剂;敏感度定义为最小可检测量。经过这些改进，即可使用本发明的新的水溶性若丹明110和若道尔衍生物底物，通过凝血酶原时间（PT）的测定、部分活化的组织促凝血酶原激酶（凝血因子Ⅲ）时间（APTT）的测定和血栓形成试验（TT，thrombotest）来检测凝血酶。

实施例

以下叙述合成水液剂呫吨鎓衍生物底物的方法、分析试验如果及使用这些底物的实施例。下述实施例并不意味着对本发明范围的限定。

除特别指出者外，所使用的所有氨基酸均为L构型。以下实施例中所用缩写符号是：

Arg＝精氨酸

Cbz＝苄氧羰基

DMF＝二甲基甲酰胺

EDAC＝1-乙基-3-（3′-二甲氨丙基）-碳二亚胺HCI