[其他]细菌酶

说明书

本发明涉及生产细菌酶的方法以及制备用于该方法的杂交质粒和微生物，本发明进一步涉及到利用上述酶中的一种，核酸酶，从生物物质中去除核酸，还涉及用于启动基因表达的调节区。

人们发现沙雷氏菌属的细菌（Serratia    Spp.）产生一些分泌到培养基质中的水解酶。与其它格兰氏阴性细菌不同，它们倾向于将蛋白质分泌到外周胞质中而不是周围的基质中。这种外周胞质蛋白有渗漏到培养基质去的趋势，特别是当细菌生长到密度很高的时候。

根据本发明，分离得到了编码沙雷氏菌胞外酶的DNA，当然，此胞外酶是在细菌内表达的，而且已培养出适于基因产品的工业生产并含有沙雷氏菌DNA的微生物，并发现它们能产生沙雷氏菌的酶。

还发现如果含有编码沙雷氏菌胞外酶的插入DNA的杂交质粒被另一个本身通常不向培养基质分泌基因产品的微生物，如大肠杆菌（E.Coli）所包含时，那么大肠杆菌则也能在一定程度上向培养基质中分泌沙雷氏菌的酶（参见实例1和6）。因此，有可能以一个比较简单的方法对由大肠杆菌的细胞分泌到培养基质中的沙雷氏菌酶进行部分纯化，例如，简单地通过过滤除去大肠杆菌细胞，并在滤液中用例如硫酸铵来沉淀酶。在本文中，术语“分泌”应理解为基因产物的转移至少要通过细胞的细胞质膜。

于是，本发明的一个方面涉及到一种生产细菌酶的方法，它包括在培养基质中培养一种包含具有编码沙雷氏菌胞外酶的沙雷氏菌DNA的杂交质粒的细胞，以及从培养基质中收集这种酶。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种生产基本上不含有其它细菌蛋白质的沙雷氏菌酶的方法，在该方法中，该酶的一部分由微生物分泌到培养基质中，并从这些培养基质中收集。

该微生物的培养最好在含有此微生物的最佳生长所需养分和无机物的液体培养基中进行。可以用本身是已知的方法来收集酶，如上所述，可以由过滤除去宿主细胞来纯化酶，并从滤液中沉淀出核酸酶。通常，然后把沉淀物溶于适当的缓冲液中，例如Tris-EDTA中，然后由透析法除去沉淀剂。

沙雷氏菌产生的水解酶中包括一种将核酸水解为核苷酸、寡核苷酸或较小核酸片段的核酸酶，以及一种水解脂类中的脂肪酸和磷脂的脂酶和磷脂酶。

所用微生物是一种典型的细菌，最好是革兰氏阴性菌。通常不希望使用沙雷氏菌来生产沙雷氏菌酶，因为沙雷氏菌是一种机遇病原菌，这可能限制人们利用它作为生产用的微生物。此外，沙雷氏菌还产生一种可能污染所需产品的胞外蛋白酶。用于生产沙雷氏菌酶的微生物，最好是象大肠杆菌这样的通常用于生产基因产品的革兰氏阴性菌。

本发明还涉及带有沙雷氏菌DNA的杂交质粒，这种DNA编码一种如上所述的沙雷氏菌胞外酶。

生产本发明的酶时，作为载体使用的质粒可以是通常用于这一目的的任何质粒，它在有关微生物中能够进行复制。可用来产生大量上述酶的质粒包括所谓的失控质粒，就是说它具有不受条件控制的复制特性。具有这种特性的质粒已在例如美国专利4，495，287和公开号为0109150的欧洲专利申请中公开了。

细菌核酸酶在纯化用微生物发酵制备的蛋白产品中有重要价值，这样的蛋白产品有用经过DNA重组技术改造的细胞发酵制备的产品，这些细胞能产生该种的天然细胞不能产生的产品。在这些产品的纯化中，一个重要的步骤是从这些由细胞产生的核酸中分离出蛋白产品。如果使用象核酸沉淀这样的常规化学处理进行纯化，由于含有所需产品的物质具有较高的粘度而难于分离，可能引起所需产品的损失，而用核酸酶分解核酸则不会引起所需产品的任何重大损失。并且，从产品中有效地完全除去核酸是很重要的，例如当产品用于人类时，一些国家的卫生管理当局规定，产品中不应含有来自用于生产有关产品的细胞的任何可杂交的DNA。

因此，沙雷氏菌产生的很重要的酶中包括一种已发现是很有效的核酸酶，它能从生物物质中除去核酸，因而具有很重要的工业价值。在本文中，术语“除去核酸”意指把长的核酸序列降解为较短的片段或寡聚核苷酸或在某些情况下降解成为单核苷酸或二核苷酸。这意味着由核酸酶作用产生的产物可以相当容易地通过常规方法除去。

因此，本发明还涉及一种细菌核酸酶，它是具有下列氨基酸序列的沙雷氏菌核酸酶，（根据已知方法由DNA序列推定，并包括了N-端信号肽）：