[其他]用微生物生产L-抗坏血酸的方法

说明书

L-抗坏血酸是一种重要的营养补充物，广泛用于维生素胶束，用在人类和其他需维生素C的动物的食物中作为营养补充物。L-抗坏血酸是一种用量日益增加的化学物质，因而产品价格至关重要，为满足市场，需要经济有效的生产方法。因此，注意力基本上集中在发展应用微生物提供有效的转化营养物的方法，旨在大量生产L-抗坏血酸。

野生型微生物只产生少量L-抗坏血酸。无法预期能否用微生物获得高产率的L-抗坏血酸。即便涉及L-抗坏血酸途径的酶之表达加强而使与营养物消耗相关的L-抗坏血酸生产增高成为可行，仍也无法预期升高的L-抗坏血酸浓度对微生物生活力和代谢的作用。所以，当已知微生物产生L-抗坏血酸时，并不能确定已经建立了经济有效的生产方法。

Loewus，F.A.在“L-抗坏血酸：代谢、生物合成、功能”（The    Biochemistry    Of    Plants，Vol.3，Academic    Press，Inc.，pp.77-99，1980）中综述了L-抗坏血酸的来源和生物合成。藻类生产抗坏血酸的描述可参见Vaidya等〔Science    and    Culture（1971）31：383-384〕;Subbulakshmi等〔Nutrition    Reports    International（1976）14：581-591〕;Aaronson等〔Arch.Microbiol（1977）112：57-59〕;Shigeoka等〔J.Nutr.Sci.Vitaminol.（1979）25：299-307〕;Shigeoka等〔Agric.Biol.Chem.（1979）43：2053-2058〕;Bayanova和Trubachev〔Prikladnaya    Biokhimiya    i    Mikrobiologyia（1981）17∶400-407（UDC    582.26：577.16〕及Ciferri〔Microbiological    Reviews（1983）47：551-578〕的文章。

提供一种应用小球藻类生产L-抗坏血酸的改进方法。用此方法在起始阶段，把小球藻生长到中等细胞密度，并通过顺序或连续加入在限制水平的碳源，维持继续生长。观察到与L-抗坏血酸生产相关的碳源利用的改进，同时获得产量增加。

提供在微生物细胞里有效生产L-抗坏血酸的新方法。方法涉及藻类在发酵罐里起始生长，罐中的碳源足够使细胞生长至中等密度。在碳源耗竭阶段，顺序或连续加入外加碳源以维持碳源浓度低于预定水平，直到加入终止为止。正常情况下，生产L-抗坏血酸的终止过程是由微生物的基本耗尽来控制的。

所需微生物是从高产菌株随机筛选获得的。可选择有希望的微生物，并用物理或化学诱变剂诱发突变，如紫外线、X-线、亚硝基脲、硫酸二甲酯等。可用氧化还原染料简便地检测确定高产株和排泄株。通过使用抗坏血酸代谢中间产物的类似物或抗坏血酸合成的抑制剂，可选择到存在化学干扰时仍能维持或增加L-抗坏血酸生成的微生物。

按每克细胞形成毫克水平L-抗坏血酸的量来测量产量的明显增加，以选择上述过程所得的微生物子代。然后进一步把这些子代分成单个克隆并再做上述同样处理。选出的藻类是小球藻属，尤其是该粉核小球藻（Chlorella    Pyrenoidosa）种。特别指出的是淀粉核小球藻UTEX1663株或其他相当的藻株。

在实行此方法时，在营养培养基中接入有活跃生长的小球藻培养物，其量足使起始细胞密度大约有0.15-0.4克细胞干重/升。培养基包括碳源、各种盐类和微量金属元素。碳源通常为葡萄糖源，包括葡萄糖。葡萄糖源可以是任何能转变为葡萄糖的糖类或多糖，例如：蔗糖、淀粉等。如果不被代谢，所用葡萄糖源的总量应达到约为65～90克/升的浓度，通常约为75～85克/升，最好约为80克/升。一般起始时加入约总葡萄糖量的15%～30%，更常用总葡萄糖量的20%～25%。通常在起始时和发酵期间都要加入葡萄糖和其他添加剂。在非限制性生长期中，葡萄糖源常维持在15～30克/升范围。此量足以避免在生长期出现受葡萄糖限制。

某些添加剂一开始就存在于发酵罐中，并随着以后加入葡萄糖源的同时补充这些添加剂，使它们的含量继续合乎需要地增添。