[发明专利]快速简便分离筛选产L-多巴(L-DOPA)菌株的方法

说明书

本发明属于从微生物的培养介质中分离微生物的方法（国际专利分类号为：cl2N1/02）。

L-多巴（L-Dopa）是预防、治疗帕金森氏病、震颤性麻痹综合症、一氧化碳中毒、锰中毒等病症的有效药物。现在，可以从野生植物藜豆中提取、化学合成等途径制取此药。但这些方法原料来源有限、工艺复杂、产率低、成本高。用微生物发酵催化L-酪氨酸合成L-多巴，其优越性是工艺简单，经济合算，适于工业化大生产，因此，必须获得高产L-多巴的菌株，但用常规方法分离、筛选产L-多巴菌株，不仅手续繁杂，时间长，而且很难得到产L-多巴的菌株。对比现有技术的不足和本发明的优点：

1.现有技术是从收集各种来源的菌株进行筛选产L-多巴的菌株C，D，但是现能转化L-酪氨酸成L-多巴并转化率高（指对L-酪氨酸）的菌种很少，从大量的现有已分离、鉴定的菌中筛选率很低，很难得到产L-多巴转化率高的菌株，对比文献D用147株菌，仅筛选到6株产L-多巴菌，而本发明改进现有技术，利用准确可靠的采样，使筛选率大大提高，曾从10个样品中筛选到8株产L-多巴菌。

2.现有技术进行筛选产L-多巴的菌株是利用已经分离、培养、鉴定和保藏的菌株，此分离、培养、鉴定的过程，大都是根据文献B的常规法进行，使用培养基种类多，操作繁杂，时间长，就文献A而论，是现有技术中能较快地从土壤中分离、培养，鉴定嗜麦芽假单胞菌，还没有检测是否产L-多巴，也要进行20多天，如果要进一步筛选产L-多巴的菌株，就总共要一月左右的时间，还不一定能筛选到产L-多巴的菌株，而本发明人曾利用本发明所获得的产L-多巴的菌株都是嗜麦芽假单胞菌，所需时间，再加上鉴定到种名，不超过16大。

3.现有技术是对每个作为筛选对象的菌株，经斜面，种子、发酵培养后进行检测L-多巴的量，所以工作量大，手续繁杂，要这样筛选大量的菌株，才能得到产L-多巴转化率高的菌，效率很低，时间长，对比文献D中147株菌，就要分别进行147次这样繁杂的筛选，而本发明由于经过创新的选择培养基对来自样品中的微生物进行了选择，并用特有的三个选择菌落指标选择分离菌株，作L-多巴定性检测，最后才进行种子、发酵培养、检测L-多巴的量，所以要进行种子、发酵培养、检测L-多巴量的这一繁杂步骤的菌株很少，大大节省了人力、物力和时间。发明人曾从10个样品中筛选到8株产L-多巴菌，也只做了8次这繁杂的最后一步骤，而且，筛选到的8株转化L-酪氨酸成L-多巴的菌株，转化率达60～97%，最好的一菌株能将8.6克/升L-酪氨酸催化合成8.4克/升L-多巴，转化率达97%。因此，本发明是一种快速、简便的方法，能很准确地分离、筛选到产L-多巴并且转化率高的菌株。

本发明的技术路线是，采取十字花科植物的根系土壤，将所采土壤与适量的无菌生理盐水混匀，然后再用无菌生理盐水按10倍稀释，取上述处理好的样品涂布在选择培养基上，在24°～30℃温度下培养3～7天，得到单个菌落。该选择培养基的组成如下：

蛋白胨10～20克

NaCl2～5克

CaCl₂0.1～0.5克

吐温80（或吐温60，或吐温20）10～20毫升

蔗糖1～4克

琼脂15克

水1，000毫升