[其他]新蛋白质和它的生产方法

说明书

本发明与对作为疫苗用的新蛋白质和它的生产方法有关。

乙型肝炎是一种病毒病害，它经常发生，特别是在非洲热带地区，东南亚地区和远东地区。在流行病学上，乙型肝炎被认为是引起慢性肝炎或肝硬变的原因，或甚至是引起原发肝癌的原因。

乙型肝炎的病原是乙型肝炎病毒（这里或以后都写作“HBV”）。它是DNA病毒的一种。发现以后被称为“戴恩颗粒”，以直径42毫微米的球形颗粒的形式存在。其外层有乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（这里或以后都写作“HBsAg”）。它包括adr、adw、ayr、ayw等亚型，它们彼此在抗原性上不同。adw和adr亚型常见于日本。

在患乙型肝炎病人的血液中，除了戴恩颗粒还能检测到比较小的颗粒和管状颗粒。已发现这些颗粒含有与戴恩颗粒中相同类型的乙型肝炎病毒表面抗原。从其他病毒中知道，对病毒表面抗原的抗体能予防所说病毒的感染。在HBV中，也许可以期望能以HBsAg为基础来产生抗乙型肝炎的疫苗，然而只有人和黑猩猩易被HBV感染。试图用它感染培养的细胞没有成功。所以HBsAg的来源受到感染肝炎病毒病人血液的限制。虽所得到的小的和其他病毒颗粒也许能满足作为制备诊断试剂材料的需要;但作为大规模疫苗生产仍是不够的。

在分子生物学中新近的发展，通过编码非细菌蛋白的DNA转化细菌，此问题已有解决可能。如果乙型肝炎病毒表面抗原的结构基因（这里和以后都写为“HBsAg基因”）能在细菌中表达作为应用这个基因操作技术的结果，则大量生产没有感染乙型肝炎病毒危险的HBsAg将成为可能，并为乙型肝炎疫苗的实际应用开辟了一条途径。

在目前所知的四种亚型adw、adr、ayw和ayr中，主要在欧洲和美洲发现的ayw亚型的乙型肝炎病毒表面抗原基因的位置和碱基顺序已被确定〔Galibert，F.等，Nature，281，646（1979）〕char-nay.P等，Nucleic    Acids    Res，7，335（1979）〕而且在大肠杆菌中它以杂合蛋白表达已有报告〔charnay，P.等Nature，286，893（1980）;Edman，J.C.等Nature，291，503（1981）〕。

本专利的一些发明者在构建含有在日本常见的亚型adw和adr的HBsAg基因DNA已经成功;所说基因DNA的碱基顺序以及它在基因组中的座位也已确定;并且通过带有这种重组DNA的转化体的培养，开辟了大规模生产HBsAg的途径（日本未审核专利公布号194897/1983，201796/1983和74985/1984）。

Machida，A.等〔Gastroenterology，85，268（1983）;ibid.，86，910（1984）〕新近报告，从乙型肝炎e抗原阳性病人的血浆中得到的HBsAg小颗粒，已经证明含有P31蛋白（分子量：31千道尔顿）和P35蛋白（一个有糖的与P31连接的结合蛋白;分子量：35千道尔顿），除了迄今已鉴定的那些主要肽之外，还有如P-    Ⅰ（分子量：22-24千道尔顿）和P-Ⅱ（分子量：25-29.5千道尔顿）〔Peterson，D.L.等，proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，1530（1977）〕。P31由P-    Ⅰ和与P-    Ⅰ的N端连接的编码55个氨基酸的Pre-S区组成，在这个区域中已经知道存在有多聚的人血清蛋白（多聚-HSA）受体。上面引用在1984年发表的报告说明上述P31蛋白有糖链。另一方面可以想到的是戴恩颗粒经由多聚人血清蛋白附着在肝细胞因而能增殖，由于多聚-HSA和受体也存在于肝细胞表面上。所以可以指望的是用对P31的抗体去成功地掩盖在戴恩颗粒上的多聚-HSA受体，则将会阻止所说颗粒与肝细胞的结合，从而有助于更有效地阻止HBV的感染。

另一方面，用各种蛋白酶对P31进行限制性水解，例如胰蛋白酶在离N-端第48个氨基酸（精氨酸）残基的位点上选择地降解P31，得到其有分子量为28千道尔顿的蛋白质（P28）。同样P31基因在啤酒酵母中表达中，由于酵母细胞中存在着大量与胰蛋白酶类似的蛋白酶，所以看到的趋向是基因产物的分解，导致P28的形成（图1）。除这个P28以外，由于酵母中存在着与胰蛋白酶类似的蛋白酶，分解P31N端的第16个和第18个精氨酸残基以及第177个和第196个赖氨酸残基的结果，其中也可能形成30-、21-和19-千道尔顿的蛋白质。