[其他]生产肽的方法

说明书

本发明涉及重组体家蚕（Bombyx    mori，蚕）核多角体病毒及应用这些重组体病毒生产肽的方法。

已经报导了利用Bombyx    mori蚕体核多角体病毒（BmNPV）来生产肽的方法（见本文末尾所引用的参考文献之参考文献1）。

该方法的主要特征包括应用重组体DNA技术，以一种期望的蛋白质结构基因置换多角体蛋白质编码结构基因区段，以建造一种重组体BmNPV，并使这种重组体在培养的蚕（家蚕，Bombyx    mori）体细胞中或活蚕（家蚕）体内繁殖，以便在其中积累期望的蛋白质。但是，这种方法在期望的蛋白质的产率方面仍不能使人满意。

此外，融合的蛋白质的生产也曾在大肠杆菌（Escherichia    coli）体中实施过，但是，其产率也不能说已经有了大的增长（参考文献2-8）。

本发明就是关于一种重组体病毒，即是一种在Bombyx    mori家蚕体核多角体病毒DNA的多角体蛋白质一个编码结构基因区段中，具有所期望的蛋白质的结构基因的重组体蚕核多角病毒，它连接到整个或部分的多角体蛋白质一编码结构基因中。该等基因之间具有或不具有中间插入的连接子碱序列。

本发明也是关于在培养的Bombyx    mori家蚕体细胞中或在活的Bombyx    mori的家蚕体内，繁殖重组体病毒从而生产融合的蛋白质的一种方法。

本发明还进一步是关于在融合蛋白质的连接位点将其分割或分解，从而生产所期望的蛋白质的方法。

在本文的附图中，

图1至图6通过一个举出的实例，用示意图表明用于生产重组体病毒的某些质粒的建造图解。

图7及图8是所期望的融合蛋白质的电泳图示。

BmNPV是养蚕工作者所广泛地知道的。T3菌株是由本发明者所分离来的一种典型的菌株。这种菌株的病毒DNA（BmNPV    DNA）已经存放于在美国典型培养物保藏中心（ATCC），其登记号码是ATCC    40188。

为了从这种病毒的DNA中分离出含多角体蛋白质的结构基因的一个区段，用限制性内切酶（EcoRI）的处理来处理是适合的，如参考文献1所述，其中有一种带有质粒pBmE36的大肠杆菌菌株（E.coli    K12JM83    DGB-0036），而质粒中含有病毒DNA的EcoRI-EcoRI片段〔约10.5千碱基（kb）〕，该片段是在EcoRI分裂位点插入到质粒中。此种菌株现已存放到日本通商产业省，工业科学与技术厅，发酵研究所，登记号码是FERM    BP-813。

此外正如在参考文献1所叙述的那样，当应用HindⅢ处理pBmE36时，可得到含有多角体蛋白质的结构基因而长度约为3.9千碱基（kb）的片段。然后将此片段插入一市售的质粒pUC9〔可由P-L生物化学药品公司（Pharmacia    P-L    Biochemicals）买到〕。随后的EcoRI分割，Bal31处理（在此，不同长度的片断可通过调节处理时间而得到）此及进一步的HindⅢ分割，或者用一种相似的方法可提供包括全部或部份多角体蛋白质基因的片段。

应用一种适当的连接子（DNA）（参考文献19），可将所期望的蛋白质的一种结构基因，连接到整个或一部份多角体蛋白质基因上，而对所产生的融合蛋白质，当用一种适当的工具在由相应的连接子碱基顺序翻译成的氨基酸或肽的位点上分割时，可生成期望的蛋白质，然后可用通常的方法将其分离。当这种融合蛋白质本身就可应用时，自然不需要分割的步骤，在这种情况下;连接子也不需存在。

众所周知，在相当于连接子的肽或氨基酸（连接部份）及用于分割或分解融合蛋白质的各种工具之中所包括的分别是：异亮-谷-甘-精的序列及能够分割序列的凝血因子Xa（下面简称“F-Xa”）;脯-Ama-甘-脯（其中Ama是任何一种氨基酸）及能够分割序列的胶原酶;精氨酸或苯丙氨酸及能够分割在融合蛋白质之后的肽键的胰蛋白酶;酪氨酸或苯丙氨酸及能够分割在融合蛋白质之后的肽键的糜蛋白酶;脯氨酸-精氨酸及能够分解在融合蛋白质之后的肽键的凝血酶;色氨酸及能够分解融合蛋白质的N-溴代丁二酰亚胺;以及甲硫氨酸及能够分解融合蛋白质的溴化氰（参考文献2-10）。连接部份及分割或分解的工具并不限于上述者。许多其他的各种肽的组合物或氨基酸以及各种的化学的或酶促的方法均可分别用作连接区段及分割或分解的工具。

较理想的是，所期望的蛋白质不含有任何一种氨基酸或肽，而该氨基酸或肽暴露在上述的连接区段分割或分解的过程时则会被分解。但是，限制性地应用恰当地受限制及缓和的条件去分解融合蛋白质，则也可能藉此达到目的。