[其他]水稻原生质体再生植株的技术

说明书

本发明属植物细胞培养技术

植物细胞原生质体再生植株是用新的非常规的生物技术改良作物品种的一个基本环节。水稻原生质体再生植株是一个难题。直到1985年日本三井东压公司藤村达人等（Fuzimura，T..Sakurai.M..Akagy.H..Plant Tissue Culture Letters.2（2）∶74-75，1985）首次发表了由日本型水稻种子的盾片及未成熟胚的细胞悬浮培养物来源的原生质体在R₂培养基中再生出了植株。

本发明的目的是用中国水稻品系作材料，在修改的培养基上获得水稻原生质体再生植株。

操作程序

（1）基因型的选取：

本发明选用粳稻品系77-170的幼花序，表面消毒后取长约3-10mm的幼花序，置于MS（加2mg/12.4D）培养基上，诱导愈伤组织。

（2）悬浮细胞系的建立：

取具有较高分化潜力的表面具小球状结构的浅黄色愈伤组织，按1g/20ml修改的AA液体培养基的比例，接种入50ml的三角瓶中进行悬浮培养，培养条件为25℃，12h/20℃，12h，150rpm，每3-4天吸出原培养基加入等量的新鲜培养基，两个月后形成分散均匀、分裂旺盛、原生质稠密的胚性细胞系，该细胞系中细胞团直径为250-350um。

（3）原生质体游离及纯化：

从悬浮细胞系中取0.5g细胞团加入10ml混合酶液（见附表1），置于黑暗27℃条件下，并轻轻摇动。3小时后95%的细胞可释放出具活性的原生质体。该混合液经孔径50um的镍丝网过滤。150g离心5分钟，吸去酶液后用清洗液（见附表2）清洗两次，然后用A₂培养基（见附表3）再清洗一次。纯化后的原生质体用A，培养基悬浮并用血球计数器计数。

（4）原生质体培养：

将悬浮于A₂培养基中的原生质体以8×10/ml的密度接种于2×4cm的玻璃瓶中，每瓶接种1.5-2ml。置于27℃条件下暗培养6小时后，80%以上的原生质体出现微微膨大。一天后约20%的再生细胞开始拉长。第3天出现第一次细胞分裂，第8天统计时，正常的一次分裂频率为3-5%。另有部分再生细胞处于明显的体细胞胚发生的状态。15-20天后加入1-2ml含0.3M葡萄糖的A₂培养基，并转移至25℃光强为2000lux的人工气候箱中，其后每隔两周分别加入与培养物等体积的含0.2M葡萄糖的A₂培养基和液体A₃培养基。两个月后将所得的直径约1mm的再生细胞团连同培养基一起均匀地倾到在固体A₃培养基表面，于相同条件下培养。10天后这种小细胞团即可长成直径约2-3mm的小愈伤组织，将这种小愈伤组织转移至分化培养基A₄表面，第10天开始出现绿色芽点，再过一周后同时分化出带1-2片小叶的绿芽和根。此时将绿芽同根一起转移至相同培养基上，半个月后，发育出叶片浓绿、分蘖旺盛的完整小植株。将此小植株转移到花盆中，可以正常开花结实。

本技术的优点：

（1）选用了较好基因型的粳稻77-170品系，并选取有利分化的幼花序为起始材料，易于再生。

（2）采用修改了的系列培养基，促进胚性细胞团和胚状体的发生，有利于再生完整植株。

附表一：混合酶液成分

Cellulase    Onozuka    R-10    1%

Cellulase    Onozuka    RS    0.5%

Macerozyme    R-10    1%

Pectolyase    Y-23    0.1%

CaCl₂.2H₂O 1470mg/L

KH₂PO₄95mg/L

Sorbitol    0.25Mol

Mannitol    0.25Mol

MES    6，000mg/L

PH5.7

附表二：原生质体清洗液成分

CaCl₂.2H₂O 1，470mg/L

KH₂PO₄95mg/L

Sorbitol    0.25Mol

Mannitol    0.25Mol