[其他]回收蛋白质的方法

说明书

本发明是关于以可溶型回收开始呈不溶型凝聚物存在的蛋白质的方法。

重组DNA技术为合成大量合乎需要的真核生物的（通常是哺乳动物的）蛋白质，例如激素、干扰素和酶等，提供了潜在的、极有价值的手段。虽然已证明控制如细菌这样的生物体来生产所需的蛋白质相对来说是容易的，但是寄主生物通常並不将蛋白质产物分泌在培养介质中。因此，这些生物（例如细菌）的溶胞作用。继之分离所需的蛋白质往往是必不可的。

在大肠杆菌中以高水平表达的真核生物蛋白质，除极少的例外，都是以不溶的蛋白凝聚物形式存在于寄主细胞之中（Marston，F.A.O.，Lowe，P.A.，Poel，M.T.，Schoemaker，J.M.，White，S.，和Angal，S.，Bio/Technology.2（9），1984，729）。例如，由大肠杆菌生产的人胰岛素，以形态学上特征的包合体存在于该细菌的细胞中（Williams，D.C.，Van    Frank，R.M.，Muth，W.L.和Burnett，J.P.，Science    215，1982，687）。这些包合体可以占据细胞的大部分容积，而且似乎是通过在该细胞中沉淀和凝聚而产生的真核生物蛋白质的定位积聚部位（同上）。

虽然利用机械方法，例如离心法和过滤法可以有效地、高产率地回收这些不溶性凝聚物，但是之后通常在进一步纯化之前必须使这些蛋白质可溶化。

按照现有技术，采用了两种主要方法，但是这两种方法均涉及伴有蛋白质变性的增溶作用，接着逐步除去这种变性剂，然后才能够使此蛋白质慢慢复性。在这些方法之中，有一个方法利用在水中的很高浓度（6-9M）的如脲素或盐酸胍之类化合物的溶液进行增溶和变性（国际专利申请WO83/04418）;另一方法则利用高pH下碱的处理使蛋白质增溶和可逆变性，然后调至较低的非变性pH下使蛋白质复性。可以将此二方法结合起来，以便改进回收率（GB8407570）。但是，即使采用这种组合方法，回收率仍然只有30%的水平（GB8407570）。

这些方法具有严重的缺点。使用脲素或盐酸胍的方法，利用的试剂可能很贵，难处理而且危险，难以除去，在生态学上是有害的，而且需用量很大。这些试剂溶液必须重复循环或加以处理，造成额外开支。结果，这些缺点影响了其进一步的大规模使用（Emtage，J.S.，Nature，317，1985，185）。况且，盐酸胍可能对蛋白质的免疫原性有害。

使用例如氢氧化钠或氢氧化钾的碱性增溶，是一种较便宜的替代方案，但是几乎没有提供任何实际的简化手续方面的优点;而且在高pH下，碱性水溶液是反应性的，使已溶解的蛋白质分子遭受不可挽救的损坏。在此二方法中，所需蛋白质的复性作用可能均不完全，导致回收率低，而且此二方法既慢又冗长。

因此，本发明的目的是克服或者至少减小现有技术所面临的一个或数个困难。

首先，提供了一种回收蛋白质的方法，此方法包括提供一个不溶型蛋白质源，至少一种阳离子表面活性剂源，用至少一种阳离子表面活性剂处理所说的不溶性蛋白质，所说的阳离子表面活性剂用量足以实现增溶作用而使所说蛋白质的结构主链基本不变。

所说的至少一种阳离子表面活性剂的量最好超过临界胶束浓度。

本发明可以具体适合于由重组DNA技术改进的微生物和真核生物细胞系合成的生物活性蛋白质的溶解和回收。这种蛋白质凝聚体可以含有由某种寄主细胞的分裂或溶胞作用分离的包合体，所说的寄主细胞可以用含有一个蛋白质基因密码的载体转化或转染的。但是本发明並不局限于此。此外，本发明可适合于对于许多生物体系共同的，天然存在的凝聚蛋白质复合物。

可以按本发明方法回收的蛋白质凝聚体，可选自包合体和细胞质凝聚体。这些包合体可选自生物活性的多肽和肽类，包括生长激素、干扰素、免疫原和淋巴细胞活素。本文中所用的术语“结构主链”是指蛋白质的一级结构和二级结构。

所说的至少一种阳离子表面活性剂的存在量，优选从约2.5-50%重量/体积，最好为2.5～20%重量/体积。表面活性剂含量的上限可以根据所选择的表面活性剂的溶解度极限变化。

我们现已发现，可以通过在有或没有一种极性溶剂存在的情况下，用一种阳离子表面活性剂在水中处理，或者单独用极性溶剂处理使所需蛋白质（包括包合物）的凝聚物增溶。此方法迅速（5-60分钟），而且回收被增溶蛋白质很容易得到而且可以重新循环。所需的只是少量的便宜试剂，它们是容易得到而且可以重新循环例如，增溶剂的主体可以是水。