[其他]卤芳香基腈降解基因，其用途以及含该基因的细胞

说明书

本申请为1986年1月8日提出的编号为817，226的申请的部分继续申请，该申请揭示的内容在此被采用作参考。

向微生物及高等有机体的细胞提供新颖的遗传特性的机会，为获得新的遗传特性开辟了一条广阔的途径。

讨论的一个方面是涉及到因其细胞毒作用而被采用的许多制剂，例如，农业上所用许多化合物直接用于杀灭害虫、杂草等。在很多情况下，这些化合物具有较长的滞留时间或者持久地残留。

在许多情况下，人们希望将那些欲杀死的物种与欲保留的物种区分开来。例如，人们常常想要有选择地杀死杂草而同时又对庄稼产生最少的不利影响。大部分情况下，许多除草剂都对庄稼产生相当大的不利影响，因而这些除草剂的应用基本上仅限于备急情况下使用或者次紧急情况下谨慎地使用。

因而要是能够对活细胞加以改进使之产生对细胞毒制剂之类的威胁的抗性就具有很大的意义。

美国专利4，535，060号描述了将草甘膦（glyphosate）抗性赋于对草甘膦敏感细胞的细菌aro    A基因的应用。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.（1976）22卷537至543页上描述了从富含土壤的培养物分离到苯甲腈（ioxynil）降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36（1976）第8，3708，号上描述了3，5-二卤-4-羟基苯基氰一类除草剂的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pesticsci.（1974）第5册287至291页上描述了溴苯腈（bronoxynil）在三种类型土壤中持久性。Smith在Abstrp.MeetingWeed    Soc.Am.（1971）的第16至17页上描述了溴苯腈在勒吉那（Regina）重粘土中的降解作用。

Smith和Fletcher在Hort.Res.（1964）上的4册第60至62页上对3，5-二囟-4-羟苯基氰和土壤微生物进行了报导。

本发明提供包含腈水解酶、为这些腈水解酶编码的核酸顺序，含有在一种所需要的宿主（腈水解酶基因对它来说是外来物）所识别的调节基因的转录的和转译的调节控制下为这类腈水解酶编码的基因的构成物、含有这类构成物的宿主细胞以及含有这些构成物的有机体、有机体部分或产物。已经发现溴苯腈和/或碘苯腈（ioxynil）特异的腈水解酶可用于含有溴苯腈及有关的除草剂的产地的去毒性之用，同时可保护宿主细胞免受这些除草剂的细胞毒作用。这些构成物发现可用于区分那些含有这种构成体的宿主细胞与缺乏这种构成物的宿主细胞。

根据本发明，可以提供与囟代羟基苯并腈，特别是3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羟基苄腈的水解有关的新颖的DNA顺序、构成物及转化了的细胞、植物以及肽。本发明涉及到能够水解腈的一种酶的生产，以便去除具有杀草活性的腈的毒力，并向对除草剂敏感的细胞，或宿主提供保护作用或者对含有该除草剂的环境进行解毒。

这种有意义的结构基因可以从显示出能够将苯基氰作为氮源，通常将苯基氰作为唯一氮源的单细胞微生物中获得，特别是从细菌中获得。关于苄腈或腈水解酶，意思是指苄腈是一种卤代P-羟基苄腈，特别是3，5-二碘或3，5-二溴-4-羟基苄腈，腈水解酶是一种能将卤代苄腈作为氮源，特别是作为其唯一的氮源的水解酶。

这种酶可以通过不同的途径获得，可以方便地从天然存在于含有溴苯腈的或磺苯腈的环境中的细菌获得。特别是肠道细菌，再进一步讲是克氏杆菌（klebsiella）种，是可获得这种酶的。肺炎克氏杆菌（klebsiella    pneumoniae），特别是变异体（klebsiella    ozaenae）是可以采用的。这些细菌可以在土壤或其它苄腈的浓度越来越高的培养基中生长，而不是从土壤中分离，减少其它的可供选择的氮源直至获得可用苄腈作为唯一的氮源而生存的细菌为止。

不管含有腈酶的细菌的来源如何，进行的筛选必须确保腈水解酶对苄腈的去毒作用效力。此外，这种腈水解酶应对苄腈具有特异性而不对缺少卤素的具有其他取代基的其他类似物具有特异性。因此，本发明的腈水解酶将是正如定义的那样是对苄腈具有特异性，对于类似物相对地是没有活性的或者活性低得多。与在可比较的浓度下以苄腈作氮源比较，在正常氮源如氨存在下，细菌的增殖率最理想的是不应显著减少，就是不少于大约10%。这一结果对于非特异性的苄腈酶是得不到的。