[其他]切向流亲合超滤法

说明书

本发明是关于从生化大分子产品的混合物中和从含有或者生产这些生化大分子产品的介质中回收和分离生化大分子产品的提纯和分离方法。更确切地说，是一种亲合色谱和切向流超滤技术相结合、可用连续流或半连续流进行操作的用于提纯或分离生物分子的生化提纯方法。该方法特别适用于提纯血红蛋白和化学改性血红蛋白，但一般也广泛适用于提纯其它生物和生化产品。

现有技术中已有多种用于分离生物分子混合物的方法。其中最有效的方法之一是亲合色谱法，一种基于生物分子与亲合凝胶特定的选择性结合而进行分离的非常有效的分离方法。亲合凝胶通常含有固定在凝胶载体上的结合配位体部分，很多具有良好分子间相互作用之特性的凝胶可以应用于亲合色谱法。

1986年6月26日公开的英国专利UK    8，615，675号以及在其它国家公开的各个相同专利介绍了血红蛋白和经过化学改性以改善载氧和循环性能的血红蛋白衍生物的提纯方法。这些方法采用亲合色谱法并且基于天然（氧合）血红蛋白与一定的亲合凝胶多阴离子部分具有特殊的结合的原理。与以前的观点相反，根据上述英国专利申请，象血红蛋白一样，（氧合）血红蛋白可以用亲合色谱法进行分离。从实用的观点出发这一发现是极其重要的，因为除了严格控制实验室条件以外，要使血红蛋白不转化为（氧合）血红蛋白事实上是不可能的。该方法适用正、负亲合吸收方式。正亲合吸收方式可用于从各种血红蛋白来源如红血球溶胞产物中提纯血红蛋白。当象红血球溶胞产物这样的混合物，在适合于血红蛋白与凝胶结合的条件下，通过亲合凝胶时，血红蛋白被滞留而混合物中的其它组分则被洗脱。然后从凝胶中洗脱滞留的血红蛋白，即得到纯净的血红蛋白。负亲合吸收方式可用于从因改性反应不完全性而剩下的未改性血红蛋白的残余物中分离改性血红蛋白（即通过任何一种已知物质的共价键附着使多阴离子结合位置进行化学改性的血红蛋白，目的是改善血红蛋白溶液作为非细胞载氧流体的不理想特性。）用该方法，未改性血红蛋白被亲合凝胶滞留，而改性血红蛋白，由于其多阴离子结合位置上明确地要由改性剂的共价键占有而不能与凝胶结合，被洗脱而成非滞留部分。上述的方法都可采用亲合色谱柱，因它有较高的专一性，所以能生产出非常纯的产品。但是亲合色谱法较慢而且是很麻烦的间歇法。

另一种已知的分离方法是薄膜超滤，它是根据分子的大小分离化合物的。这种方法中最简单的方式是使溶液流过带有确定大小孔的过滤器，溶液中尺寸太大不能通过孔的溶质便与能够通过孔的部分分离。但是，这种过滤方法由于未滤过的溶质聚集在过滤器上，最后阻塞液体流过过滤器而受到限制。

最近，采用切向流超滤这种新方法（Gabler.F.R.ASM    News，vol.50    No.7（1984）P299）解决了这个问题。用该方法，使溶液平行流过过滤膜，液体流不断清洗过滤器表面从而防止非滤过溶质阻塞。薄膜两侧的压力差促使流体和过滤溶质流过过滤器。这种方法可以按连续流的方式进行操作，因为在溶液重复地流过膜的同时，穿过过滤器的流体则被连续地引出，进入一个独立的回路。但是，由于切向流超滤仅仅是根据分子的大小进行分离，所以缺乏象用于亲合色谱法那样基于生物专一性进行选择性分离的能力。

本发明包括将切向流过滤用于连续流分离的方法。采用该方法，滞留部分与非滞留部分的分离是根据分子大小通过梯度过滤实现的，另外也采用了亲合凝胶分离法，其中亲合凝胶置于溶液或含有被分离组分的混合物中，做过滤器的上流侧，由于凝胶颗粒比溶质颗粒大得多，所以可以选择既能使得未结合溶质即没有与凝胶结合的溶质通过过滤器，同时又能防止凝胶颗粒和任何与凝胶结合的物质通过的过滤器。

根据本发明，提供了一种用于从含有生物意义上的分子的混合物中分离生物分子的方法，它包括，在至少有一种大分子亲合物质存在的条件下，使所说的混合物经过切向流超滤，大分子亲合物质与所说的生物分子进行特定的结合从而防止它们滤过，而其它较小分子则被过滤除去。

根据本发明还提供了将第二种生物大分子和第一种生物大分子分离开来的方法，包括用亲合凝胶处理含有所说第一种和第二种生物大分子的混合物，亲合凝胶只是选择性地结合所说第一和第二种大分子中的一种，而对另一种大分子不结合，随后，使含有与亲合凝胶结合的大分子的混合物进行切向流超滤，从而在超滤的滤渣中得到与亲合凝胶结合的大分子，在滤液中得到不与亲合凝胶结合的大分子。

这里所说的“生物大分子”是指分子量至少约为1000道尔顿的、天然生物或生化来源的或由生物或生化方法得到的分子。