[其他]DNA和它的应用

说明书

本发明涉及生产肌苷的方法。肌苷是合成5′-肌苷酸时作为起始材料的重要物质。本发明还涉及生产肌苷酸的新微生物及组建这些新微生物所用的新DNA。

人们已知发酵生产肌苷酸是用一种芽孢杆菌（见日本公告专利号2965/1980，41915/1982，42895/1984），Brevibacterium（日本公告专利5075/1976，见农业生物化学1978年42期399页）或需要腺嘌呤及既需腺嘌呤又具几种药物抗性的类似菌株。用这些菌株是由于它们生物合成嘌呤核苷酸的能力都很强。

另一方面，用肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株可大量积累肌苷，因为当肌苷酸脱氢酶缺乏时，生产肌苷的一种中间体5′-肌苷酸就可有效地转化为肌苷，而不转化为5′-乌苷酸。为此目的，就常用影印法或用诸如紫外线和亚硝基胍（NTG）处理的突变方法筛选需要黄嘌呤或乌嘌呤的菌株。

然而这样得到的营养缺陷型菌株有很多缺点，例如：由于它们在有关酶的基因以外其它区域的突变，产率会低于它们的母株，也会在发酵期间由于回复突变而使产率浮动。

根据这种情况，本发明人研究了如何得到肌苷酸脱氢酶缺陷型菌株，结果用重组DNA技术将为肌苷酸脱氢酶编码的基因DNA并入一个来自该基因外的合适的DNA片段，构建出具有这种染色体DNA结构的新的微生物。本发明人发现用这种技术从受体微生物中诱变的新微生物是选自需要腺嘌呤的芽孢杆菌，它们可重复使用于高效稳定地生产肌苷。因为它们可大量积累肌苷，而在发醇过程肌苷脱氢酶活性的回复突变率又低于可观测的标准。本发明正是基于这个发现而完成的。

因此，本发明包括：

1.为钝化（失活的）肌苷酸脱氢酶编码的DNA，它与芽孢杆菌的肌苷酸脉氢酶基因及/或它的两侧区是同质的。

2.上述（1）定义的DNA，它具有插入某一DNA片段的肌苷酸脱氢酶基因区，从而得到所说的失活的基因。

3.如上述（2）定义的DNA，其中的DNA片段是除肌苷酸脱氢酶以外的其它基因。

4.如上述（3）定义的DNA，其中所说的其它基因是选择标记基因。

5.如上述（1）定义的DNA，其中所说的DNA删去肌苷脱氢酶完整基因或它的一部分。

6.含有上述〔1〕，（2），（3），（4）或（5）所定义的载体。

7.用上述（1）-（5）定义的DNA或（6）定义的载体转化的芽孢杆菌。

8.生产肌苷的方法，包括在培养基中培养肌苷酸脱氢酶缺陷型的芽孢杆菌，该菌是用为失活的肌苷酸脱氢酶编码DNA转化的，该DNA是与肌苷酸脱氢酶基因区和/或它的两侧区同质的，该菌也可是用插入该DNA的载体转化的，所以该菌可生产肌苷，并可收集培养液中生产出的肌苷。

为得到本发明所用含肌苷脱氢酶基因的DNA，用常规方法，即用限制性内切酶从微生物染色体DNA中将其切下，例如：可根据日本公告专利156388/1985及相应的欧洲专利0151341的方法分离和克隆DNA。在这种情况下，DNA既含为肌苷酸脱氢酶编码DNA，又含少量两侧部分的DNA;然而，含有部分肌苷酸脱氢酶基因的DNA或既含部分该基因又含两侧基因的DNA都可应用。

根据上述定义，任何提及的DNA均可用做肌苷酸脱氢酶的整个区，只要该区为一个长1.85千对碱基的XbaⅠ-HincⅡ片段。

作为肌苷酸脱氢酶给体，原则上可用任何的微生物，只要它的肌苷酸脱氢酶区碱基序列与受体芽孢杆菌菌株的该酶编码DNA序列是高度同质的。从操作的角度最好用芽孢杆菌的，因为它自我无性繁殖，得到的转化体稳定。给体不一定必需是能生产肌苷，乌苷、黄苷或它们相应碱的菌株。但所用菌株必须不是肌苷酸脱氢酶缺陷型的。可用作给体芽孢杆菌菌株的例子诸如：枯草杆菌，短小芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，具体可提及下列已知菌株：

枯草杆菌NA-6011（IFO14189.FERMBP-291）

枯草杆菌NA-6102（IFO14190，FERM    BP-292）

枯草杆菌NA-7821（IFO14368，FERMBP-618）

枯草杆菌NA-6128（IFO14373，FERMBP-617）

枯草杆菌NO-115（IFO14187）

枯草杆菌NO168（BGSC    NoIAI）

枯草杆菌MI114（基因124，255〔1983年〕）

短小芽孢杆菌（FERMP-2116）

短小芽孢杆菌（FERMP-4832）

短小芽孢杆菌（FERMP-4829）