[发明专利]生物合成灭活素的方法

说明书

本发明涉及到用重组DNA技术生产一种新的人蛋白—灭活素(minactivin)及其基因DNA序列的确定，以及具有生物活性的灭活素在重组宿主中的大量表达及纯化。本发明也涉及到有生物活性的天然灭活素及其多肽的纯化和它们的氨基酸顺序。

灭活素(DAI-2)是一种天然存在的尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物的失活剂。这一类型的血纤维蛋白溶酶原激活物在许多主要的人癌尤其是肺、结肠、乳腺及前列腺癌中其含量异常高。血纤维蛋白溶酶原激活物是一些丝氨酸蛋白酶，它们参与细胞转位、迁移和侵袭中的蛋白多级降解过程。因此，它们似乎是与组织的破坏和重建有关，并参于了肿瘤的生长和转移，也可能在炎症反应中起作用。

血纤维蛋白溶酶原激活物一般有两种类型：1)尿激酶型及2)组织型。组织型血纤维蛋白溶酶原激活物主要见于血和血管壁中，它负责激活血纤维蛋白溶解的防卫系统防止血栓形成。尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物在正常的血栓溶解过程中不起作用，但它却参与侵袭和组织破坏的病理变化，尤其是参于肿瘤转移和炎症反应的病变过程。

已报道的几种血纤维蛋白溶酶原激活物的特异性抑制剂，其中有自胎盘中分离的抑制剂(Holmberg，L.Biochim.Biophys.Acta544，128—137(1978))和在培养的血管内壁细胞中产生的抑制剂(PAI-1)(Vam Mourik，J.A，Lawrence，D.A.，Loskutoff，D.J.，J.Biol.Chem.259，14914—14921(1984))。灭活素发现于人血单核细胞和U937细胞中，并与来自胎盘的抑制剂呈免疫学相关。这些抑制剂彼此之间的关系目前还不清楚。

灭活素也象大多数其他有生物活性的蛋白一样，在体内的产生量是非常低的。因此难以用常规的生化方法进行纯化和鉴定。为进一步评价它的性质和在临床应用中的功效，需要制备大量的纯品。利用重组DNA技术，即通过把这种基因克隆到另一宿主如细菌或动物细胞中中，以获得这一蛋白产物。为了克隆这一基因，需先对能获得的少量的天然灭活素纯化成均质，以便制备抗体，获得肽段及氨基酸顺序和合成寡核苷酸。从而为克隆路线提供依据。

            缩写词

HPLC:     高压液相色谱

Mr：      相对分子量

MW:       分子量

PMA：     十四酰佛波乙酸酯(4-phorbol-12-myris-

          tate-13-acetate)

SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

TFA:      三氟醋酸(trifluoracetie)

HPA：     人血纤维蛋白溶酶原激活物

bp：      碱基对

Kb：      千碱基对

PU：      Ploug

本发明的首要实施是提供一种DNA顺序，它包含作为为灭活素氨基酸顺序编码的全部、部分、类似物、同源物、衍生物或其组合的第一DNA顺序，和同所述第一DNA顺序杂交的DNA顺序，及一种由突变(包括单个或多个碱基替换、缺失、插入和倒位)产生的与上述第一DNA顺序有关或能够杂交的DNA顺序，或者是在表达时为灭活素多肽编码的全部、部分、类似物、同源物、衍生物或其组合的一种DNA顺序，或者它所编码的多肽能显示出与灭活素有类似的免疫学或生物学活性。该顺序为：

          1