[其他]改进的融合产物

说明书

由Kohler和Milstein在1975年所进行的小鼠骨髓瘤细胞与已被免疫的小鼠脾细胞的融合（Nature.256（1975），495-497），首次证实了连续获得产生同型（所谓的“单克隆的”）细胞系的可能性以及由这些杂交瘤制造的抗体在各种科学研究和医学珍断上的应用。制备杂交瘤的方法一般包括下列步骤：

（a）用一种致免疫剂免疫小鼠或大鼠一类动物。所用的免疫方案应该能够产生有用量的适当的已接触抗原的脾细胞。

（b）从被免疫的动物体中取出脾脏，在一种合适的介质中制成脾脏悬浮液。

（c）在一种合适的融合促进剂存在的条件下，将该悬浮的脾细胞与从一合适的细胞系得来的骨髓瘤细胞进行融合。融合促进剂可以是仙台病毒或是一化学融合剂，如平均分子量约1000至4000的聚乙二醇（（PEG）（如商业上可得到的PEG1000等）。另一项有效的融合技术是根据已知方法的电-融合，如Zimmermann和Scheurich（Planta，151（1981），26-32）、Vienken等（Planta，151（1983），331）以及Jacob等（Sbud.Biophys，94（1983），99）等所使用的方法。所用的骨髓瘤细胞系最好是所谓的“抗药”型，以便使未融合的骨髓瘤细胞在选择性培养基上不能存活，而杂种则能存活，最普通的一类是8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，由于它缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，从而不能够在HAT（次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸苷）培养基中存活。

（d）在各个容器中用选择培养基稀释并培养未融合的脾细胞，未融合的骨髓细胞和融合细胞的混合物，这种培养基将不能维持未融合的骨髓细胞以长时间而使未融合细胞死亡（约一周）。稀释可以是一种有限型，其中稀释剂的体积是通过统计学方法计算出来的，以便分离一定量的细胞数（如微量滴定板的每一孔）。在选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞死掉。由于未融合的脾细胞是非恶性的，它们仅有有限的代数，因此，经过一段时间后（约一周），这些未融合的脾细胞将不能繁殖。而另一方面，融合细胞由于具有骨髓瘤亲本的恶性性质以及脾细胞亲本的在选择培养基上的存活能力，所以能够连续繁殖。

（e）鉴定在含有杂交瘤的每一容器（孔）中的上清液中抗体的存在，这种抗体是直接抗最初所使用的抗原的。

（f）筛选（如通过有限稀释）和克隆产生所需抗体的杂交瘤。

一旦所需的杂交瘤被筛选和克隆，则最终的抗体可以通过两种方式之一产生。最纯的单克隆抗体是在试管中在一种合适的培养基上对所需的杂交瘤进行适当时间的培养而产生的。然后由上清液中回收所需要的抗体。该适宜的培养基和适当的培养周期为已知的或很易确定。这一试管技术生产的基本是单一的单克隆抗体，基本上无其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培养基中含有异种血清（如牛胎儿血清），所以该抗体中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，这一试管方法不能够产生用于某些目的的大量抗体或抗体浓缩物，因为单克隆抗体的浓度仅约50微克/毫升。

为了产生在量的纯度稍底的单克隆抗体浓缩物，可以将所需的杂交瘤注射进小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。适当培养一段时间后，杂交瘤将引起产生抗体的肿瘤的形成，导致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液（腹水）中所需抗体的浓度增高（约为5～20毫克/毫升）。

这一方法在文献中已充分公开，它有特别的和严重的缺点。PEG作为融合剂已被越来越多的人所接受，因为其纯品易于得到且在所需的分子量范围内，并且与仙台病毒比较起来它较容易操纵。但是，PEG有效的整个浓度范围非常窄。最佳浓度是50±5%（重量/体积）。在这一浓度下，它表现出对将被融合和已经融合了的所有细胞的细胞毒效应。另一方面，当使用亚最佳浓度的PEG时，仅现定到适度的细胞毒性，但是融合效率以及其后的杂交瘤形成都很低。与仙台病毒相比，已知的化学融合剂如PEG和电-融合不影响被融合的细胞的凝集，因此，细胞膜在紧密贴近处对融合并非直接有效。

因此，本发明的目的之一就是提供能够产生有用产物的新型融合杂交细胞。本发明的目的之二是发展一种制备杂交细胞的方法，它是将能够产生有用产物的哺乳动物细胞或植物细胞（如胰岛细胞）与能够连续繁殖的合适的融合配偶体进行融合。本发明的目的之三是要减少常规的化学融合剂的细胞毒作用，这些融合剂包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO（二甲基亚砜）、聚乙烯醇、聚-L-鸟氨酸以及已知有用的盐如硝酸钠或其组合物。在融合方法中，这将导致产生高产量的所需的杂环交细胞。本发明的目的之四是产生将被电-融合技术融合的凝聚细胞。