[其他]人溶菌酶的生产

说明书

本发明涉及生产人溶菌酶的DNA重组技术。更具体地说，本发明涉及人溶菌酶基因的表达、重组质粒、转化细胞及其产物。

溶菌酶是一种较小的酶蛋白，分子量约为14，000。溶菌酶分布于活体组织中，人们认为它是作为防御物质而起作用的，它通过溶解各种细菌而抵抗细菌感染。溶菌酶的功能可能是通过β-葡糖苷酶活性来溶解细菌细胞壁的多糖。鸡蛋清中含有大量溶菌酶，因此从其中能够比较容易地分离到高纯度的溶菌酶。这样的溶菌酶可为了防腐目的加到干酪、香肠和海产品中，或用于将牛奶转化成人的哺乳奶（Katsuya    Hayashi和Taiji    Imofo，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974）。而且，溶菌酶作为医疗药剂可用于止血、消炎、组织再生和抗肿瘤等（参见“Saikin-no-Shinyaku”（日本新药）Vol.34.107，Yakuji    Nippo，Tokyo，Japan，1983），并且，它已经作为消炎酶药剂上市了。

将来自鸡蛋清的溶菌酶用于医疗目的时，通常导致过敏症状如疹子和发红等。这些现象一般称为对外源蛋白免疫应答的副作用。为了克服上述弊病，本发明者开始了研究以建立一种大量生产人溶菌酶的方法。

人溶菌酶的氨基酸序列是已知的，它由130个氨基酸组成（“Biochemical    Data    Book”，1：189，1979，日本生化学会主编）。以此氨基酸序列为基础，化学合成了编码人溶菌酶的DNA片段（Ikehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，34：2202，1986）。

为了利用DNA重组技术生产人溶菌酶，Muraki等人试图在大肠杆菌中进行表达，但用这种表达系统没能得到活性人溶菌酶（Muraki，M等人，Agric.Biol.Chem.，50：713，1986）。

已经发现，通过酵母的分泌作用得到了一种活性人溶菌酶（Jigami等人，《1986年日本农业化学学会概要》，P.343，1986）。但其产量非常低，只有600微克/升。根据Jigami等人的报道，在人溶菌酶的表达中，与编码人溶菌酶的DNA片段相结合，使用了一种编码信号肽的CDNA片段，此信号肽具有将所需蛋白分泌到细胞外的信息。作为编码信号肽的CDNA片段，使用的是编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的CDNA片段（天然型）（此信号肽的序列与Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5759-5763，1980中公开的相同）。然而，进行了这样的结合后，如上所述，从酵母细胞中分泌到胞外的溶菌酶数量仍然很少。

本发明者利用DNA重组技术对于活性人溶菌酶的大规模生产进行了详尽的研究，研究结果是完成了本发明。

虽然，人溶菌酶基因目前还未被克隆，但已经确定了溶菌酶的氨基酸序列。因此，以此氨基酸序列为基础，Ikehara等人已经化学合成了编码人溶菌酶的DNA（Ikehara，M.等人，同上）。

因此，有可能利用此化学合成的DNA通过DNA重组技术大量生产人溶菌酶。

作为与编码人溶菌酶的DNA片段一起使用的编码信号肽的DNA片段，可以提及的有编码下述结构式的信号肽的DNA片段：

M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G

考虑到要在酵母中进行表达，因此，最好是利用酵母中高频率使用的密码制备编码蛋清溶菌酶信号肽的DNA片段。使用这样的DNA片段，发现能以增加的水平达到大量获取人溶菌酶的预定目标。密码子使用率已有过报道（J.Biol.Chem.，257：3026-3031，1982）。优选的酵母密码子的实例在下面以RNA密码子的形式给出。

氨基酸    密码子    氨基酸    密码子    氨基酸    密码子

Ala    GCU，GCC    His    CAC    Tyr    UAC

Ser    UCU，UCC    Glu    GAA    Cys    UGU

Thr    ACU，ACC    Gly    GGU    Asn    AAC

Val    GUU，GUC    Gln    CAA    Pro    CCA

Ile    AUU，AUC    Lys    AAG    Met    AUG

Asp    GAC    Leu    UUG    Trp    UGG

Phe    UUC    Arg    AGA

图1给出了通过寡聚核苷酸的集中和连接合成人溶菌酶基因的方法的示意图;