[发明专利]微生物发酵正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法

说明书

本发明是利用微生物发酵从正烷烃生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是高产十六碳二羧酸的方法。

长链二羧酸是一类重要的化工原料，可用来制造耐寒性增塑剂，工程塑料、树脂、涂料以及香料。特别是十六碳二羧酸，是制造环十五烷酮的重要原料，后者具有纯麝香香味、是一种高级麝香香料。

从七十年代起，各国利用微生物氧化正烷烃生产长链二羧酸的研究和应用取得了突破性进展，八十年代起进入了工业化生产阶段。1972年日本的内尾良辅等人在《农业·生物化学》杂志（Agr.Biol.Chem.Vol.36）“微生物利用正烷烃产生长链二羧酸”的文章中，报道了他们用阴沟假丝酵母MR-12菌株在1立升发酵罐中，用醋酸钠作生长碳源，加入15%（V/V）的正十六烷发酵72小时，得到63.3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的转化率为54%。1978年内尾又在《石油和微生物》杂志（《石油と微生物》NO.20，1978）报导了扩大试验的结果，在300立升罐里，醋酸作为生长碳源，正十六烷作为发酵碳源发酵68小时，得到54克/升，十六碳二羧酸，正十六烷转化率70%。这是目前十六碳二羧酸产量最高，规模最大的报导。1985年，日本植村等人在《石油和微生物》NO.33（石油と微生物》NO.33）上报导用热带假丝酵母的突变菌株M2030在3升罐上发酵94-113小时从9-18个碳的正烷烃（加入量30%V/V）分别产生相应的二羧酸，其中11-15个碳二羧酸的产量分别为62克/升。82克/升，96克/升，100克/升和90克/升，正烷烃转化率在30-45%之间，而十六碳二羧酸产量较低，每升不到50克。

本发明的目的是提供一种用热带假丝酵母从10-18个碳正烷烃发酵生产长链α·ω-二羧酸的方法，特别是高产十六碳二羧酸的方法。

本发明所用的菌株为热带假丝酵母UH-3-9高产突变菌株（Candida    tropiealis    UH-3-9），是以一株两端氧化正烷烃生成长链二羧酸能力较强的热带假丝酵母（见《微生物学报》20（1）：88-93，1980）为出发菌株，通过硝基胍和紫外线多次诱变，选育出来的一株ω-氧化能力更强，同化正烷烃能力和β-氧化能力更弱的突变株。本发明所用的菌株保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCCNO.0129。

本发明的种母培养基有（1）10个巴林的麦芽汁加2%琼脂制成的固体斜面;（2）10个巴林的麦芽汁液体培养基;（3）烷烃液体培养基包含KH₂PO₄6-8克/升，蔗糖2-4克/升，酵母膏2-4克/升，玉米浆2-4克/升，尿素2-4克/升，重蜡40-50毫升/升，消泡剂（甘油聚醚）约400ppm，自来水配制，pH值5左右。培养种母的过程为：取一接种环UH-3-9酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上（15×180试管，每支装液量6-7ml，放成斜面）于28-30℃培养两天。取一支上述斜面菌种，接入30ml/250ml三角瓶的麦芽汁液体培养基或25ml/500ml三角瓶烷烃培养基，于28-30℃在200转/分的旋转摇床上培养36-48小时，作为发酵种母。

用本发明的高产突变菌株热带假丝酵母UH-3-9生产长链α·ω-二羧酸，特别是十六碳二羧酸的具体方法是：将发酵种母接入pH值为5.5-8.0含有5-40%（V/V），最好为10-25%（V/V）10-18个碳原子的正烷烃和95-60%（V/V），最好为90-75%（V/V）发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐4-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2克/升，丙烯酸0.5-2毫升/升，表面活性剂吐温60    0.1-2.0克/升及其它营养源。将上述混合液在24-34℃，最好是26-32℃下维持48-144小时，然后将产生的α·ω-二羧酸进行分离提纯，其具体做法是：发酵结束后的液体加热至80-90℃加NaOH把pH值调至10-12，然后用离心机离心，收集离心清液和残存烷烃，除去菌体。含有残存烷烃的离心清液，在20℃以下静置过夜，烷烃在表面形成白色固体块，回收再用，大量大颗粒的十六碳二羧酸钠盐结晶沉于底部，倾出上清液，收集钠盐结晶，清液浓缩用同法处理收集十六碳二羧酸钠盐。把十六碳二羧酸钠盐溶解于80-90℃热水中，加入浓HCl，调pH值至2-3，静置冷却结晶过夜。最后收集白色二羧酸结晶固体，在60℃烘烤至干。