[其他]2-氨基-4-甲膦酰丁酸抗性基因及其应用

说明书

Phosphinothricin（PTC，2-氨基-4-甲膦酰丁酸）是谷氨酰胺合成酶的抑制剂。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦酰-丙氨酰-丙氨酸的“结构单位”。此三肽（PTT）具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及抗真菌灰葡萄孢（Botrytis    cinerea）的活性（Bayer等人，Helv.Chim.Acta    55∶224，1972）。PTT是由绿色产色链霉菌（Streptomyces    viridochromogenes）Tu    494菌株（DSM40736，DSM4112）产生的。

德国专利2，717，440号公开了PTC可起全除莠剂（total    herbicide）的作用。已公开的PCT申请WO86/02097号描述了植物对PTC的抗性是归因于谷氨酰胺合成酶的过量生成。这种类型的过量生成（如从基因扩增所导致的）易遭受不稳定的风险。因此，这样一种不稳定性将带来谷氨酰胺合成酶过量生成的下降，将致使重新出现PTC的竞争性抑制作用。

与之相反，在权利要求中所限定的本发明涉及一种PTC抗性基因及其在生产PTC抗性植物中的应用。此外，该基因还可作为抗性标记使用。而且，该基因可适于L型外消旋PTC的选择性N-乙酰化作用。

本发明的PTC抗性基因能由下述步骤得到：用BamHⅠ酶切以PTT抗性选择出来的绿色产色链霉菌DSM4112菌株的总DNA，克隆大小为4.0Kb的片段，然后选择PTT抗性。限制性图谱（图1）详细描绘了该4.0Kb片段的特征。

对该4Kb片段部分进行克隆实验，以更精确地确定编码区的位置。此实验结果表明，抗性基因位于1.6Kb的SstⅡ-SstⅠ片段上（图1中位置0.55至2.15）。用BglⅡ消化产生0.8Kb大小的片段，此片段掺入质粒中并转化变铅青链霉菌（S.lividans）后赋予PTT抗性。此抗性是由PTC的N-乙酰化产生的。

对此0.8Kb片段进行Maxam和Gilbert序列分析得到DAN序列Ⅰ（见附页）。抗性基因的位置可从这一序列的开放读码（open    reading    frame）确定（从位置258起）。此基因读码终点位于图示的倒数第二个核苷酸（位置806），即最后一个核苷酸（位置807）是终止密码子的第一个核苷酸。

用下加线条强调标明了DNA序列Ⅰ中的Shine-Dalgarno序列，作为起始密码子的GTG也用线条标出。而且，顶部线条标出了确定的读码。

DNA序列Ⅱ显示已确定了序列的基因中的限制性切点。没有标出切断此序列六次以上的酶。

抗生素PTT由细菌摄取并被降解为PTC。后者也抑制细菌中的谷氨酰胺合成酶，致使细菌因缺乏谷氨酰胺而死亡。因此，产生PTT的细菌应当具有保护自身不受PTT影响的机理，也就是说，防止再度摄取已生产的PTT，或者对已降解的产物PTC进行修饰。但令人吃惊的是，PTT生产菌绿色产色链霉菌DSM4112对其自身的抗生素敏感。但出人意料地证实，通过选择PTT抗性，有可能以10^-5的极高频率发现抗PTT的选择体，而且，此选择体还能抑制相邻菌落的本底生长。

通过分离此DNA、用BamHⅠ切断并连接到链霉菌载体中建立了这些选择体DNA的基因库。将连接混合物转化到市售的变铅青链霉菌TK23菌株中，每1μg连接混合物产生大约5000至10000个含有大约1至5Kb插入段的转化体。在这些转化体中有PTT抗性变铅青链霉菌株。有可能通过质粒分离并重新转化到变铅青链霉菌中，证明该抗性是由质粒编码的。负责此抗性的基因位于4Kb    BamHⅠ片段上（图1）。编码区位于0.8Kb    BglⅡ片段上。BamHⅠ片段中不含下列酶的切点：ClaⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PvuⅠ、PvuⅡ和XhoⅠ。

将抗性基因的限制性图谱（还没有详细确定其特征）与吸水链霉菌（S.hygroscopicus）FERM    BP-130/ATCC21705（欧洲专利申请，公开号0，173，327，图7）相比较表明，本发明的抗性基因不同于已知基因，其为寻找PTT生物合成基因过程中发现的。

一方面使绿色产色链霉菌DSM4112和变铅青链霉菌TK23的细胞提取物与PTC和乙酰辅酶A保温，另一方面使PTT抗性的绿色产色链霉菌选择体和携有质粒的变铅青链霉菌转化体与PTC和乙酰辅酶A保温，有可能表明后面的细胞将具有乙酰化活性。层析分析表明乙酰化发生在氨基上。