[其他]酰基载体蛋白-DNA序列及合成

说明书

本申请是1986年7月31日提交的美国专利申请891529号的后续部分。

酰基载体蛋白是于蛋白质可被分离作体外使用，或者可使蛋白于细胞内被转移到叶绿体或与体内修变脂肪酸产生有关之细胞器内的条件下被转录的。本发明所提供的构建物可在种子组织中使用种子特异性启动子表达酰基载体蛋白。

植物为食品原料和食物成品提供了丰富的来源。植物脂肪酸可广泛用于多种工业目的，如作为植物油用于烹调，用作润滑剂以及在醇酸树脂中用作特殊化学品等。大部分植物脂肪酸为18碳原子的，通常只有少数脂肪酸具有16个以下的碳原子。就许多应用目的来说，期望具有8至14个脂肪酸的脂肪酸。为此，在建立生产其中大部分脂肪酸为14或少于14碳原子之植物油的方法上集中了相当大的兴趣。

为达到这一目的，必须改变导致脂肪酸生成並使之伸长为较高级脂肪酸之代谢途径的组成成分。为此，必须能够产生一种或多种脂肪酸代谢链上的成分，並借以改变植物代谢过程。此外，脂肪酸代谢途径中的个别成分还可能具有重要的工业应用价值。

Kuo和Ohlrogge（Archives    of    Biochem.and    Biophys.（1984）234：290-296）描述了菠菜酰基载体蛋白的一级结构。Ohlrogge和Kuo（J.Biol.Chem.（1985）260：8032-8037）报导了在不同组织中有不同表达的酰基载体蛋白的不同异构体。Crouch等人（J.Mol.Appl.Genet.（1983）2：273-283）报导了编码napin蛋白之cDNA的合成。

本发明提供了用于表达植物酰基载体蛋白的DNA构建物。特殊构建物是使用在种子成熟期间的植物胚胎中导致表达的转录起始区制成的。可通过改变参予脂肪酸生成之代谢途径的叶绿体或相关细胞器中的组成成分来调节脂肪酸的量和组成。

本发明提供了生产酰基载体蛋白的方法及成分，其中酰基载体蛋白作为一种体外使用的或连同植物种子生成的终产物，可用以修变体内脂肪酸的表达。为此目的，须制备DNA构建物，其中是将编码植物酰基载体蛋白的序列连接到在预期宿主中有表达酰基载体蛋白之功能的转录起始和终止调节区上。

该表达构建物在转录的5′-3′方向上提供了一个转录起始调节区（其为结构性的或调节性的）、一个编码酰基载体蛋白之至少一种功能性蛋白的开放读码，期望包括一个用于转位到叶绿体上作体内使用的转换肽序列，以及一个在适当的宿主中有功能活性的转录终止调节区。

调节区将根据所用宿主而有所不同。当在原核或真核微生物，特别是单细胞宿主内表达时，可使用多种结构性的或可调节的启动子。在这些情况下，制备酰基载体蛋白的主要目的是将此酰基载体蛋白于体外使用。

大多数情况下，构建物将包括在植物中有功能活性的调节区，用以提高酰基载体蛋白的产生，进而借以提高和/或修变脂肪酸组成。

所用的编码序列可得自于天然来源，亦可以是合成的，或者以此两种途径得到的。为从天然来源获得基因，可使用多种植物或细菌作为基因的来源。这些植物包括菠菜、芸苔属植物如油菜或甘蓝型油菜、椰子、棉花、红花、向日葵、萼距花等。用以获得基因的各种方法包括制备基因组成cDNA文库。可基于酰基载体蛋白的氨基酸序列来制备探针。因为不同来源的酰基载体蛋白之间存在有相当程度的免疫交叉反应性，故可利用原核和真核生物的多克隆抗体自某特殊来源中分离酰基载体蛋白，並进一步用于自其它植物来源分离酰基载体蛋白。之后测定整个的或部分的酰基载体蛋白序列，並基于肽序列设计探针。如只测得部分DNA序列，该部分序列即可满足需要，或者移动基因以确保得到整个编码序列。

一旦得到了预期的序列，即可以各种方法操纵之。当序列包括非编码的侧接区时，可使用核酸酶如Bal31切断侧翼区，亦可用限制性核酸内切酶作限制性酶切，或者使用体外诱变、引物修复来进行修饰，或者用其它方法向序列内引入突变或损伤。这样即在天然存在的序列上完成了转换、颠换、缺失和插入。此外，可以合成全部或部分序列，其中可改变一个或多个密码子以提供修变了的氨基酸序列，或者引入一个或多个密码子的突变以提供方便的限制性酶切点或达到其它与构建或表达有关的目的。可进一步使用合成的接合物或连接子，向基因内引入一个或多个方便的限制性酶切点。

酰基载体蛋白可以是任何一种可见于某特殊宿主内的同工酶，如由Ohlrogge和Kuo定名的见于菠菜中的ACP-Ⅰ和ACP-Ⅱ（见上述文献），或者见于其它植物宿主内的其类似物。