[发明专利]新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法

说明书

本发明涉及一种新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法，具体地讲，涉及一种由培养新的芽孢杆菌Bacillus    sectorramus所得到的α-1，6-葡萄糖苷酶，该菌能在最适pH5.0至5.5、最适温度55℃条件下经培养产生α-1，6-葡萄糖苷酶，另外还涉及一种生产上述新的α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，该方法包括培养上述菌种并收集α-1，6-葡萄糖苷酶。

α-1，6-葡萄糖苷酶具有对淀粉类中的α-1，6-葡萄糖苷键发生作用以产生直链淀粉的能力，并且广泛用于糖化工业，生产麦芽糖、葡萄糖和高果糖玉米糖浆（HFCS）。

α-1，6-葡萄糖苷酶长期以来发现于高等植物和微生物酵母中，但近期有报道许多细菌可以产生这种酶，例如：产气杆菌（Aerobactor    aerogenes），中间埃希氏菌（Escherichia    intermedia），Pseudomonas    amyloderamosa，缓症链球菌，（Sterptococcus    mites），噬纤维菌（Cytop    hage），链霉菌属（Streptomyces）和α-叶红呋喃菌属（Flavochromogenes）等。

另外，在产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌种中，已知的种类有蜡状芽孢杆菌（Bacillus    cereus）（IFO    300），坚强芽孢杆菌（Bacillus    firmus）（IFO    300），Bacillus    acidopullulyticus等。

大多数已知的α-1，6-葡萄糖苷酶具有中性或弱碱性的最适pH值，不适于在糖化工业中使用，工业上的糖化作用一般在酸性条件下进行。

已知由Pseudomonus    amyloderamora，Bacillus    acidopullulyticus等产生的α-1，6-葡萄糖苷酶具有酸性最适pH值，但是由于抗温性差，前者是不能实际使用的;而后者菌体培养时间需长达60-73小时，所以是不经济的。

因此，本发明人试图寻找具备抗温性、酸性的最适pH值和高的α-1，6-葡萄糖苷酶产量的微生物。

本发明人最近在土壤微生物中发现了一种新的芽孢杆菌菌株，它经过10-15小时短时间的培养再收集其产物能够得到大量的α-1，6-葡萄糖苷酶，在此基础上，本发明人完成了本发明。

根据本发明的一个方面，提供了一种生产α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，该方法包括培养能产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌Bacillus    sectorramus使其在培养条件下产生α-1，6-葡萄糖苷酶，然后收集所述的α-1，6-葡萄糖苷酶，它具有如下酶化学性质：

（1）反应：该酶作用于α-1，6-葡萄糖苷键产生线性淀粉;

（2）底物专一性：该酶对多糖具有下列相对活性：

多糖    相对活性（%）

支链淀粉    100

可溶性玉米淀粉    13.5

可溶性淀粉    6.7

牡蛎糖原    1.7

野兔糖原    2.6

玉米淀粉    3.8

马铃薯淀粉    4.0

（3）米氏常数值（Km）和对支链淀粉的Vmax：该酶的Km值为0.14mg/ml，Vmax值为70.0μmol/分钟/mg蛋白质;

（4）最适pH：5.0-5.5;

（5）pH稳定性：该酶在pH范围4.5-6.5、温度40℃条件下可稳定30分钟;在pH值5.0-6.0，温度50℃也可稳定30分钟;

（6）最适温度：约55℃;

（7）热稳定性：该酶在pH值为4.5条件下，分别以不同温度处理30分钟所得结果表明在40℃时，该酶仍保留其初始活性的80%，60℃时活性则为10%;

（8）抑制剂的影响作用：对氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸钠至少可抑制该酶活性的70%，但该酶不受邻-菲咯啉或氰铁酸钾的抑制;

（9）金属盐类的影响作用：该酶几乎不受Ni²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺或Mn²⁺的影响，受Fe³⁺的抑制，并且Hg²⁺和Ag²⁺可使其失活;

（10）分子量：约95，500（用SDS电泳法测得）。