[其他]重组牛痘病毒

说明书

本发明涉及一种重组牛痘病毒，更具体地说，涉及一种通过用减毒的利斯特（Lister）温度敏感突变牛痘病毒菌株作为载体而得到的重组牛痘病毒，这种菌株在兔肾细胞中不具有高温生长性，并在受精卵的绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸。

近年来，已经发明了一个插入异源DNA的构建重组牛痘病毒的方法，并建议了用插入，例如：编码传染病病原体抗原的DNA作为异源的DNA来构建的重组牛痘病毒用作活疫苗的方法（例如：USP4，603，112，WO84/02077，等）。

该方法是按照例如下面的步骤（见图1）来实现的。首先，用限制性内切酶从对牛痘病毒生长非主要的一个DNA区中切出适当的DNA，并插入到一个质粒中以制备一个第一重组质粒。然后，把异源的DNA插入到该重组质粒的牛痘病毒的DNA部分来制备一个第二重组质粒。

另一方面，制备事先用牛痘病毒感染了的动物细胞，并把第二重组质粒导入到该动物细胞中，由此在该感染动物细胞中引起了牛痘病毒和第二重组质粒之间的同源重组，并产生了一个具有该异源的DNA导入其中的重组牛痘病毒（例如，上面提到过的那些现有技术文献，Cell    Technology    vol.2，NO.9，P.84-87（1983），等）。

按照该方法，根据不同的用途可插入各种各样异源的DNA，并且该方法作为生产活疫苗的新方法很有用。

然而，在常规方法中使用的牛痘病毒大多是WR株（上面提到过的现有技术文献，Journal    of    virology    49，857-864（1984），等），但由于这些牛痘病毒经常会发生像脑炎或脑病以及进行性牛痘这样一些严重的接种后的并发症，所以出于安全的观点，它们很难用于实践。

因此，本发明人为了开发一种安全的活疫苗进行了研究，结果发现利用一种减毒的利斯特温度敏感突变株（即一种在兔肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵的绒毛尿囊膜上具有小痘疱尺寸的减毒的利斯特温度敏感的突变牛痘病毒菌株）来代替WR株作为载体是很有效的，并在以前已申请过专利（日本专利申请号18590/85）。

但是，尽管通过这种方法获得的重组体在安全方面是很满意的，但它在表达效率上是不足的，这是因为插入在该牛痘病毒基因组中的异源DNA是处在该牛痘病毒的非主要DNA区固有的启动子控制之下。上述的重组体已发现是有缺点的，特别是由于在将它接种到实验的哺乳动物上时，很难得到一种通过该异源DNA编码的蛋白质引起的免疫作用。

本发明的一个目的是要通过将彼此邻接的具有启动子功能的DNA和异源DNA插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变体中以提供一种具有高表达效率的牛痘病毒菌株。

本发明的另一个目的是要提供一个制备上述牛痘病毒的重组方法。

本发明还有一个目的是要提供一个通过培养上述牛痘病毒株来生产疫苗的方法。

于是，按照本发明，提供了一种重组牛痘病毒，它是通过把彼此邻接的具有启动子功能的DNA和能在它控制下表达的异源DNA插入到一个减毒的利斯特温度敏感突变牛痘病毒株的非主要DNA区得到的，该突变牛痘病毒株在兔肾细胞中不具有高温生长性并在受精卵绒毛尿囊膜上具有小的痘疱尺寸;还提供了一个制备上述牛痘病毒的重组方法及生产疫苗的方法。

图1显示了一个制备重组牛痘病毒方法的示意图。图2显示了比较例2的实施方法。图3至图6显示了实例1的实施方法。

用于将异源DNA插入其中的牛痘病毒是一种减毒的利斯特株病毒的温度敏感突变体，它在受精卵的绒毛尿囊膜上痘疱的大小为3毫米或更小，最好为1毫米或更小，比原菌株（即利斯特株）的痘疱小，而且它在兔肾细胞中的停止温度为41℃或更低些，最好是40.5℃或更低些。

在这里所使用的术语“减毒的”意指所说的突变体在兔和猴的中枢神经系统中呈现出显著低于原菌株（即利斯特株）的致病力，并且基本上不会由于末梢的感染而侵袭到小鼠的中枢神经系统（见日本专利申请公开号44178/87的实例4）。一个特别优越的突变体是把该突变体按5.8log₁₀TCID₅₀/〔一次〕剂量接入到重量为2.0至2.5公斤的日本白兔后的6天，由10%脑匀浆中回收到病毒量是2log₁₀TCID₅₀/ml或更少，最好是1或更少。