[其他]甘油醛-3-磷酸脱氢酶的生产

说明书

本发明涉及用重组DNA技术生产甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶是在糖酵解过程、糖元异生作用及碳固定过程中起作用的一种酶。人们发现，在植物，动物和细菌的胞液中，该酶催化甘油醛-3-磷酸转化为1，3-二磷酸甘油酸，在叶绿体中它催化此反应逆向进行，作为开尔文循环的一部分。

已确定了三种细菌的GAPDH序列：一种是从嗜常温细菌大肠杆菌中得到（Branlant    and    Branlant，Eur，J.Biochem.，150：61    1985），另外两种来自嗜热细菌即嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus    stearo    thermophilus）（Walker    et    al.，Eur.J.Biochem.，108：549    1980a）及水生栖热菌（Thermus    aguaticus）（Walker    et    al.，Eur.J.Biochem.，108：581，1980b）从大肠杆菌中得到的该酶与真核细胞胞液GAPDHs的同源性要大于从嗜热菌中得到的GAPDHs的同源性（Branlant    and    Branlant，1985）。基于序列对比分析和S环的疏水性质（残基178-201;见Walker    et    al.，1980a/b;Branlant    and    Branlant，1985），可以得出下述结论：GAPDH根据其热稳定性沿两条独立直线演化，因为曾有人建议，形成四聚体核心的S环的疏水性，决定全酶的热稳定性（Walker    et    al.，1980b）。因此，所观察到的真核细胞和嗜热菌GAPDHs氨基酸顺序的区别反映了嗜常温和嗜热生物之间的差别。

高等植物中具有两套糖酵解酶;胞液中的糖酵解酶在糖酵解过程中起作用，而叶绿体中的糖酵解酶在光合成固定碳过程中起作用（Gottlieb，Science，216：373，1982）。胞液的和叶绿体的糖酵解酶都由核基因组编码（Weeden    and    Gottlieb，J.Hered.，71：392，1980;Gottlieb，1982;Cerff    and    Kloppstech，Proc.Natl    Acad.Sci.（USA），79：7624，1982）。

高等植物中有两种叶绿体GAPDH同功酶（综述见Cerff，Methods in Chloroplast Molecular Biology，eds，Edelman et al.，Elsevier/North Holland，Amsterdam，683，1982），同功酶Ⅰ和Ⅱ，亚基结构分别为A₂B₂和A₄，另外还有唯一的胞液GAPDH，亚基结构为C₄。胞液GAPDHs结构为种间高度保守，跨越很大进化区间（Tso et al.，Nuc.Acid Res.，7：2485，1985a）。

叶绿体是植物的一种半自主细胞器，它的大多数功能需要由叶绿体和细胞核基因编码的基因产物参与。能得到并提供为植物GAPDHs，特别是为叶绿体衍生的GAPDHs编码的基因顺序是很有意义的。

本发明的目的在于提供一种从可以无限供给的植物叶绿体和胞液中，用遗传工程方法获得基本上纯的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的新来源。

据本发明，编码从烟草（Nicotiana    tabacum）得到的叶绿体GAPDH（GapA和GapB）和胞液GAPDHs（GapC）的细胞核基因的cDNAs已被克隆并鉴定。

因此，本发明提供编码这些酶的遗传序列，含有这些序列的载体，以这些序列转化得到的宿主生产这些酶的重组DNA技术。

图1示出用自动Edman降解法测定的烟草叶绿体GAPDHs、A₄及A₂B₂各亚基N-末端氨基酸顺序。

图2表示基于GAPDHs氨基酸顺序得到的GAPDHs寡核苷酸探针（见正文）。上面的一条表示蛋白质中该探针的相对位置及用于合成寡核苷酸探针的相应氨基酸顺序。下面的四条表示4个寡核苷酸探针的顺序。在寡核苷酸中具有4倍简并度处用“N”代表。

图3表示cDNA克隆从烟草叶至该4种合成寡核苷酸的杂交形式。