[其他]转氨酶基因ILVE的克隆和应用

说明书

体内合成脂肪族氨基酸的最后步骤包括借助氨基转移酶使相应的酮前体产生胺化。虽然各种转氨酶均可完成转氨基反应，生成脂族氨基酸，但这种作用在细胞内主要是靠脂族转氨酶完成的。遗传学中所用的脂族转氨酶基因的缩写符号是iLvE（Umbarger，Ann.Rev.Biochemistry    47（1978），533-606）。对于大肠杆菌K12来说，已确切知道了该基因在“细菌染色体”上的定位，其基因产物为E.C.2.6.1.42号（Bachmann等，Microbiological    Reviews    44（1980），1-56）。

欧洲专利申请（EP-A）0116860号描述了分离大肠杆菌K12中iLvE基因及将这种氨基转移酶基因克隆到一个多拷贝质粒上的方法，没有说明被克隆的iLvE基因产物的生物活性。EP-A    0152275号中提到通过克隆iLvE基因来提高酶的活性，但没有关于增加脂族氨基酸产率的资料。

现已发现，分离大肠杆菌ATCC11303中的iLvE基因，並将其克隆到一个多拷贝质粒中，再用这一质粒转化始发菌株之后，可使该氨基酸的产率至少增加3到5倍。

因此，本发明涉及：

1、一个染色体外的复制成分，其含有自大肠杆菌ATCC11303分离的iLvE基因。

2、由（1）指出的“染色体外”复制成分，在脂族氨基转移酶合成中的应用。

3、由（1）所规定的“染色体外”复制成分在微生物体内过量产生分枝链氨基酸中的应用，包括

a）将“染色体外”复制成分引入微生物内;

b）在该微生物内表达iLvE基因並合成有活性的脂族转氨酶;

c）由转氨基酶与相应的酮前体产生胺化作用。

本发明在说明书的详述部分及权利要求书中给以更充分的说明。

该基因不仅可用于野生型大肠杆菌ATCC    11303，而且还可用于其变种和突变体。例如，它可用于由已知方法（E.Adelberg等Biochem.Biophys.Res.Comm.18，788（1965））致突变的菌株以及根据过量产生分枝链氨基酸而选择的菌株。大肠杆菌ATCC    11303中iLvE基因编码的脂族氨基转移酶，可借助这种酶自谷氨酸盐转移氨基，由相关酮前体合成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。此外，亦可使用脂族转氨酶合成苯丙氨酸和谷氨酸。除iLvE基因产物外，还发现了大肠杆菌细胞中的其他转氨酶基因的产物。

例如，芳族转氨酶是tyrB基因的产物，可催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的合成，aspC基因的产物催化天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成。然而，上述的转氨酶也在其它族的氨基酸合成中显示微弱的活性。

为了进一步增加分枝链氨基酸的合成，而克隆了编码脂族氨基转移酶的iLvE基因。先分离大肠杆菌ATCC11303的DNA，部分消化该DNA之后，将所得的20-30Kb的片段连接到有复制子的装配型质粒中（该质粒具有广泛的宿主），並包裹在λ噬菌体的头部。装配型质粒最好选用pIMS    6026。该质粒是由装配型质粒pLAFR    1（ATCC37167）衍生来的就是将编码有转座子Tn    903的卡那霉素抗性基因的商品EcoR1片段（Pharmacia，Uppsala，Sweden）克隆到pLAFR1的单一EcoR1切点中。因BamHJ切点两侧邻接2个EcoR1切点，用BamH1酶切删去EcoR1片段的大部分，保留作为插入部分的短DNA片断。这个不存在于装配型质粒pLAFR    1上的BamHI切点可用于克隆。将适当配制的大肠杆菌DG    30悬液与已包装的装配型质粒保温，将装配型质粒引入微生物体内。大肠杆菌DG30缺少三种转氨酶aspC、iLvE和tyrB。因此，尽管该菌株能在完全培养基上生长，但在基础培养基上生长须添加它们不能合成的各种氨基酸。由于适当地选择培养基，有助于检测该菌株是否已由外界摄入的DNA来弥补其染色体合成特殊转氨酶的缺陷。iLvE基因的引入是由大肠杆菌DG    30在无酪氨酸基础培养基上生长而确定的。只有能通过摄入含有aspC、tyrB或iLvE的DNA以补足其染色体合成酪氨酸的缺陷，且来源于大肠杆菌菌株ATCC    11303的克隆才能在这种培养基上生长。由基因aspC、tyrB和iLvE编码的三种转氨酶的区别在于它们的底物不同-尽管所有这三种转氨酶都能催化酪氨酸的生成。